[发明专利]一种检测JAK2基因突变的引物与方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种检测JAK2基因突变的引物与方法。

背景技术

JAK/STAT通路是造血生长因子广泛应用的信号传导通路，该通路的激活与多种肿瘤相关。JAK2基因编码Janus酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)，参与造血细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等多种反应。

骨髓增殖性疾病(Myeloproliferative neoplasms，MPN)是一系或多系分化相对成熟的骨髓细胞不断克隆性增殖所致的一组肿瘤性疾病的统称，其中以真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、骨髓纤维化(MF)最常见。MPN发病机制不明，但大部分患者存在JAK2基因突变的情况，其中，JAK2的14号外显子V617F突变是最为常见的突变，见于约95%的PV、约50%的ET和MF患者中。2007年Scott等首次报道JAK2 V617F阴性的PV患者中存在JAK2基因12外显子的突变，相关研究数据显示，JAK2基因外显子12和13主要影响红系发育，约2%-4%的PV患者JAK2基因外显子12、13发生突变，但未发现JAK2基因外显子12、13突变与ET以及MF等JAK2 V617F阴性的其它MPN的相关性。

和JAK2 V617F单一位点突变不同，JAK2基因外显子12的突变形式多样，涉及所编码蛋白的第536至547位氨基酸，突变类型包括点突变、缺失及插入，JAK2基因外显子13突变形式则主要为点突变(COSMIC)。

中国专利申请201110396831.1公开了检测JAK2基因突变的引物和探针，该专利申请将特异性引物与双环探针相结合，通过荧光PCR实现了JAK2基因突变的检测，但存在反应体系复杂，需要多种引物和荧光定量PCR仪的缺点。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测JAK2基因突变的引物与方法，该引物具有特异性好、灵敏度高等优点，实现了检测JAK2基因外显子12和外显子13突变的准确检测。本发明检测的位点包括JAK2基因外显子12和外显子13。

本发明提供一种检测JAK2基因突变的引物，包括针对JAK2基因外显子12的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTTTGGAGCAATTCATAC(SEQ ID NO.1)和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCCATCTAACACAAGGTTGGCATA(SEQ ID NO.2)，以及针对JAK2基因外显子13的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTTTCTGTCTCTTATTACTATTTA(SEQ ID NO.3)和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCTCCTCAGAAAAGTCCTTGACACATT(SEQ ID NO.4)。

优选地，所述引物中，外显子12的上游引物、外显子12的下游引物、外显子13的上游引物和外显子13的下游引物浓度比为1：1：1：1。

相应地，本发明还提供一种检测JAK2基因突变的方法，包括如下步骤：A）提取DNA样品；B）采用权利要求1或2中所述的引物进行PCR扩增；C）对扩增产物进行凝胶电泳分析后，采用Sanger测序法检测，对检测结果进行分析。

优选地，所述步骤A）中的DNA样品为EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA样品。

优选地，所述步骤B）中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：63℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。

优选地，所述步骤C）中，采用Sequencher 4.1.4软件对检测结果进行分析。

此外，本发明还提供检测JAK2基因突变的引物在制备检测JAK2基因突变试剂中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种检测JAK2基因外显子12和外显子13突变的引物，该引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本发明还提供了一种检测JAK2基因外显子12和外显子13突变的方法，通过使用特异性的引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可以作为JAK2 V617F检测阴性的真性红细胞增多症患者的辅助检测方法，进而为其临床用药提供指导。

附图说明

图1 本发明提供的JAK2基因外显子12引物的扩增片段。

图2 本发明提供的JAK2基因外显子13引物的扩增片段。

图3 PCR扩增产物的凝胶电泳图。