[发明专利]一种快速检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的方法及引物组合物有效
| 申请号： | 201510570028.3 | 申请日： | 2015-09-08 |
| 公开（公告）号： | CN105132556B | 公开（公告）日： | 2017-12-12 |
| 发明（设计）人： | 段亚冰;周明国;陈长军;杨莹;王建新;张晓柯 | 申请（专利权）人： | 南京农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645 |
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| 地址： | 210095 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 快速 检测 葡萄 qoi 杀菌剂 抗性 方法 引物 组合 | ||
1.一种用于检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测引物组合物：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成；各引物序列具体如下：
FIP：5’-CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’；
BIP：5’-TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTAATGGCA-3’；
F3：5’-GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’；
B3：5’-GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
2.一种检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测方法，步骤为：
(1)运用权利要求1所述的两对特异性引物对待测样品的基因组DNA进行LAMP恒温扩增，反应体系为10μL，包括1.2μM正向内引物FIP，1.2μM反向内引物BIP，0.3μM正向外引物F3，0.3μM反向外引物B3，0.6μL 10×ThermoPol Buffer，1.5mM MgCl2，1.0mM dNTPs，0.2M甜菜碱，1.5mM羟基溴酚蓝(HNB)，1.6U Bst DNA聚合酶，加入无菌超纯水；反应参数为59-61℃ 60min，80℃ 10min；
(2)对上述LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下观察结果，若存在梯状条带，则证明所检测的灰葡萄孢菌为QoI类杀菌剂抗性菌株；若无梯状条带，则证明所检测灰葡萄孢菌为QoI类杀菌剂敏感菌株；或观察LAMP反应溶液颜色变化，若为天蓝色，判定为QoI类杀菌剂抗性菌株；若为紫色，判定为QoI类杀菌剂敏感菌株。
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