[发明专利]一种定量检测广东虫草的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法

说明书

本发明公开了一种定量检测广东虫草的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法。定量快速检测广东虫草的特征性核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。定量快速检测广东虫草的核酸分子引物，该核酸分子引物为：FS：5`‑GCTCCGATTCGATGGC‑3`；RS：5`‑TACAGCAGGCAGGTGGC‑3`。利用本发明的核酸分子引物FS和RS进行荧光PCR扩增，仅广东虫草能够激发荧光信号，而其他虫草如冬虫夏草、蛹虫草和分枝虫草均在循环数小于35时均无Ct值，表明了本发明的核酸分子引物FS和RS具有很高的特异性，可以用于快速检测广东虫草(菌丝体和子实体)及其相关制品的真伪和含量。

技术领域：

本发明属于利用分子生物学方法检测中药材真伪的技术领域，具体涉及用于检测广东虫草(Cordyceps guangdongensis)的特征性核苷酸序列以及分子引物和定量检测广东虫草的方法。

背景技术：

广东虫草(Cordyceps guangdongensis T.H.Li,Q.Y Lin&B.Song)是2008年在广东境内发现的特有虫草新品种。经研究发现，该虫草安全无毒可食，具有较好的抗氧化活性、抗疲劳和延寿作用等。广东虫草的虫草素和腺苷含量虽比蛹虫草低、但比冬虫夏草高，其虫草酸含量与冬虫夏草比较接近，具有较好的开发应用价值和市场潜力。2013年国家卫生部批准“广东虫草子实体”成为新资源食品，是继蛹虫草之后的又一个“虫草子实体”新资源食品，可作为冬虫夏草的替代品，缓解了虫草市场的压力，也丰富了虫草市场。因此，研制快速、定量检测广东虫草及其相关制品的真伪及含量技术对广东虫草产业的健康发展具有重要的意义，对广东虫草的商业化生产与产品检验具有实质应用价值。在前期的研究中，专利发明人已申请并获得了国家发明专利授权的“鉴别广东虫草的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法ZL201110212383.5.”，该专利只能对广东虫草进行定性检测，而不能定量检测。

内参基因(reference genes)是在不同个体及组织细胞中均稳定表达的基因，又叫管家基因(house-keeping gene)，常用的内参基因如微管蛋白(tubulin)，β肌动蛋白(β-actin)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)，18s RNA真核生物核糖体RNA(18s rRNA)等(张玉芳,2014)。在生物学研究中，内参基因主要用于对目的基因定量结果的校正，即需要判定实验结果是基因本身的表达量的高低，还是操作过程中造成的误差，所以需要同时检测内参基因作为参照。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供了能够用于快速检测广东虫草(菌丝体和子实体)相关制品的真伪以及检测广东虫草含量的广东虫草的特征性核苷酸序列。

本发明的定量快速检测广东虫草的特征性核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，共包含234bp的碱基。该定量快速检测广东虫草的特征性核苷酸序列源于广东虫草的α-tubulin蛋白编码基因序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，共包含1498bp的碱基)。

本发明的第二个目的是提供扩增上述定量快速检测广东虫草的特征性核苷酸序列的核酸分子引物，其特征在于，该核酸分子引物为：

FS：5`-GCTCCGATTCGATGGC-3`；

RS：5`-TACAGCAGGCAGGTGGC-3`。

上述核酸分子引物序列FS和RS的退火温度相近，均不能形成引物二聚体。该核酸分子引物不与冬虫夏草、蛹虫草和分枝虫草等虫草起反应，仅与广东虫草发生反应而具有极高的特异性。在荧光定量PCR过程中依据荧光信号的强弱来检测底物中广东虫草的含量，且灵敏度高。因此，利用该核酸分子引物通过荧光定量PCR扩增可以快速地对广东虫草(菌丝体、子实体)及其相关制品的真伪进行检测并且能测定其含量。