[发明专利]利用RNAi沉默SceIF4E1基因培育抗条纹花叶病甘蔗的方法

权利要求书

1.一种与SCSMV的VPg互作的甘蔗翻译起始因子基因SceIF4E1，其特征在于所述基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.一种利用RNAi沉默SceIF4E1基因培育甘蔗抗SCSMV品种的方法，其特征在于：

(1)RNAi干扰靶序列的获得：

针对SceIF4E1基因的保守区段，设计一对特异性引物Sc4E1-F和Sc4E1-R，在上游引物Sc4E1-F上引入Xba I和EcoR I酶切位点，下游引物Sc4E1-R上引入HindⅢ和Kpn I酶切位点；通过PCR反应获得5′端带有Xba I和EcoR I酶切位点，3′带有HindⅢ和Kpn I酶切位点的PCR产物；将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，获得RNAi干扰靶序列；所述上游引物Sc4E1-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；下游引物Sc4E1-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；RNAi干扰靶序列的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；所述SceIF4E1基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(2)RNAi干扰载体构建：

(a)正向片段S1的获得：用EcoR I和Kpn I对RNAi干扰靶序列进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收正向片段S1；正向片段S1的序列为序列表中SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列；

(b)中间载体pS1的获得：用EcoR I和Kpn I双酶切pHANNIBAL载体，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，然后用T4 DNA连接酶将酶切产物与正向片段S1连接，并将连接产物转化至受态大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中，挑取阳性克隆验证，得到中间载体pS1；

(c)反向互补片段S2的获得：用Xba I和HindⅢ双酶切RNAi干扰靶序列，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收反向互补片段S2；所述反向互补片段S2的序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

(d)中间载体pS1S2的获得：用Xba I和HindⅢ双酶切载体pS1，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，用T4 DNA连接酶将回收产物与反向互补片段S2连接，并将连接产物转化至受态大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中，挑取阳性克隆验证，得到以pHANNIBAL载体上的内含子intron作为间隔区、具有发卡结构反向互补序列的中间载体pS1S2；

(e)发夹结构片段的获得：用NotⅠ单酶切中间载体pS1S2，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收发夹结构片段；所述发夹结构片段的序列为序列表中SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；

(f)RNAi干扰载体pG0229-4E1的获得：NotⅠ单酶切pGreenII0229载体，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，然后用T4 DNA连接酶将回收产物与发夹结构片段连接，并将连接产物转化至受态大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中，挑取阳性克隆验证，得到可用于甘蔗遗传转化的RNAi干扰载体pG0229-4E1；

(3)遗传转化、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载体pG0229-4E1质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μL，基因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。