[发明专利]枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法

权利要求书

1.一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，然后以基因组DNA为模板PCR扩增枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因，PCR扩增过程中，在上游和下游引物中分别引入BamHI和XbaI酶切位点，制得枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因Cot；

所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotB、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotC、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotD、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotH、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotX、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotY或枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotZ；

(2)以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增，制得海藻糖合成酶TreS的核苷酸序列；

(3)去除步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因Cot的终止子，然后采用融合PCR与步骤(2)制得的TreS基因进行融合，融合PCR过程中，在上游和下游中分别引入限制性内切酶BamHI和AatII的酶切位点，制得融合基因Cot-TreS；

(4)将步骤(3)制得的融合基因Cot-TreS经BamHI和AatII双酶切后，与同样经BamHI和AatII双酶切的表达载体pHT01连接，制得重组质粒pHT01-Cot-TreS；

(5)将步骤(4)制得的重组质粒pHT01-Cot-TreS转化枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168，转化后经涂布含氯霉素的LB平板进行筛选，然后经碘液显色方式进行转化子鉴定，获得阳性菌株；

(6)将步骤(5)制得的阳性菌株经DSM培养基35～37℃诱导培养45～50h，制得表面展示海藻糖合酶的重组芽孢。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG的PCR扩增引物，核苷酸序列如下：

CotG-F：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT

CotG-R：GCTGGGTCATTCTAGATTTGTATTTCTTTTTGACTACC

PCR扩增体系如下，总体积50μL：

2×HiFi-PCRMaster25μL，引物CotG-F2.5μL，引物CotG-R2.5μL，Bacillussubtilis168基因组2.5μL，ddH₂O17.5μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min10s，共30个循环；72℃继续延伸10min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR的扩增引物，核苷酸序列如下：

TreS-F：TAAGTATTTTATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC

TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT；

PCR扩增体系，总体积50μl：

2×HiFi-PCRMaster25μL，引物TreS-F2.5μL，引物TreS-R2.5μL，pET15b-TreS2.5μL，ddH₂O17.5μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃继续延伸10min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)来源于美国模式培养物集存库，保藏编号：ATCC47054。