[发明专利]用于诊断肝癌的唾液检测试剂及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种诊断肝癌的试剂及试剂盒。

背景技术

我国是肝癌大国，肝癌的发病率和死亡率都占了全球的一半以上。肝癌的准确诊断具有重要的现实意义。

现时，国际上通常用来筛查肝癌的生物标志物是血清AFP(甲胎蛋白)。但其敏感性只有39％至65％，特异性只有76％至94％。由于其检测肝癌的敏感性跟特异性不甚理想，因此美国的治疗指南不推荐血清AFP用于肝癌的诊断。中国跟欧洲的治疗指南都指出，正常个体的AFP水平应小于20ng/ml，大于400ng/ml则可提示肝癌的诊断。而20至400ng/ml则是诊断的“灰色地带”。因此利用AFP筛查肝癌容易导致误诊漏诊。

除了血液取样方式，另一种诊断方式是组织取样诊断。然而，肝组织取样对人体破坏性强，因此，亟须一种没有创伤式而准确的诊断方法。

人体唾液腺中存在许多毛细血管网，因此，唾液是血液循环的末端产物。血液中存在的分子物质，例如DNA、RNA、蛋白、药物、病毒等，都能在唾液中找到。因而唾液被认为是人体健康状态的一面镜子，能反映出机体的各种内环境状态，例如癌症、感染、系统性疾病等。美国的食品及药物管理局(FDA)已经批准了利用唾液检测药物滥用、HIV感染、激素水平、中毒等试剂在市场上应用，现已在全美都已经得到普及。在临床中，于唾液中寻找分子标记物是最理想的方法，因为收集唾液存在简单、方便、无创、经济、不会引起患者不安、操作者易于掌握等优点。研究已经证实了唾液中的转录物、蛋白、代谢物和其他分子物质能检测出口腔癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、干燥综合征等其他口腔或者系统性疾病。体内的微小RNA(microRNA，miRNA)与包括肝癌在内的多种癌症的发病与发展密切相关。研究发现多种miRNA在肝癌组织中表达失调，组织中表达失调的miRNA可作为生物标记物对肝癌有较佳的诊断价值。但唾液miRNA是否可作为生物标记物协助诊断肝癌，目前尚无报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于诊断肝癌的唾液检测试剂和试剂盒。

本发明同时提供了试剂盒的使用方法。

本发明还提供以唾液作为检测样本的方法。

发明首先提供了用于诊断肝癌的唾液检测试剂，该试剂为miR-21检测试剂，该试剂的检测对象为唾液样本。

发明同时提供了miR-21唾液检测试剂在制备检测肝癌试剂或试剂盒中的应用。

以唾液作为样本来进行肝癌标记物的检测，最大的难点在于，需要寻找到能分泌到唾液中的，且在唾液中能稳定存在的标记物。尽管目前已有大批的肝癌标记物被发现，这些标记物存在于组织样品或血液样品中，然而，同样的标记物采用唾液样本取样，往往是另一个结果，不能用作肝癌诊断。这很可能是因为能被分泌到唾液中的标记物本身就很少，并且唾液中存在大量的酶，标记物容易降解。因此，以唾液样本检测肝癌，在此前仍未见任何报道。

而本发明的一大突破在于，发明人发现，在肝癌患者中其唾液样本存在大量的miR-21。其稳定而大量地存在，能被高重现性地检出。而正常样本中，该标记物表达水平非常低。这使得miR-21成为一种良好的唾液样本标记物，对于肝癌的检测或诊断具有突破性的意义。

本发明进一步提供给了用于诊断肝癌的唾液检测试剂盒，其含有蛋白酶和miR-21检测试剂。

上述的miR-21检测试剂含有检测用引物，所述引物的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。

作为可选的实施方式所述的蛋白酶选自蛋白酶K。

优选地，所述的试剂盒还含有酸酚氯仿混合物。并且进一步优选地，还可含有DEPC(焦碳酸二乙酯)。

可选地，所述的酸酚氯仿混合物为盐酸-苯酚-氯仿混合物；优选地；苯酚与氯仿的体积比为(4.5-5.5):1；更优选地，所述的酸酚氯仿混合物pH值为4.3-4.7。

发明还提供给了一种检测唾液miR-21的方法，包括以下步骤：提取唾液中总RNA后，进行miR-21的逆转录，再通过qPCR(定量聚合酶链反应)检测miR-21水平。

提取唾液miR-21的方法可采用以下步骤：

S1.取唾液样本，加入蛋白酶，60-65℃孵育以去除唾液蛋白；

S2.加入酸酚氯仿混合物后，10000-12000g离心4-6分钟，收集上清；

S3.加入1.25倍体积的乙醇，再经5000-6000g离心20-60秒过滤离心，弃滤液；

S4.加入预热的DEPC水，10000-12000g离心20-60秒，收集RNA。