[发明专利]一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法及其应用

权利要求书

1.一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、根据Genebank中公布的罗伊乳酸杆菌pheS基因序列设计特异引物，然后以罗伊乳酸杆菌L.reuteri XNY基因组DNA为模板扩增得到L.reuteri XNY的pheS基因；

S2、利用软件将L.reuteri XNY的pheS基因与其它细菌的pheS基因进行比对，结合已发表文献确定pheS基因突变位点，再设计点突变引物利用重叠PCR技术获得pheS基因的点突变基因pheSM；

S3、选取目的基因插入位点，以罗伊乳酸杆菌L.reuteri XNY基因组DNA为模板PCR扩增获得插入位点上下游700bp同源臂片段LR和RR；然后扩增启动子片段P、红霉素抗性基因EM片段，再利用重叠PCR技术将其与pheSM基因和同源臂片段连接，得到LR-P-pheSM-EM-RR整合框架；

S4、将LR-pheSM-EM-RR整合框架电转化至L.reuteri XNY感受态细胞，利用红霉素抗性筛选得到pheSM基因重组罗伊乳酸杆菌；

S5、利用重叠PCR技术将所需插入的目的基因与插入位点两端的同源臂序列连接，得到目的基因整合框架，再将其电转化至pheSM基因重组罗伊乳酸杆菌感受态细胞，利用对-氯-苯丙氨酸(p-Cl-Phe)抗性筛选即可获得无抗性标记的目的基因整合菌株；

所述步骤S2中所述的pheS基因点突变引物序列为：

c：ATACGGCGGTTTTGGCTTTGGACTTGGACC；

b：GGTCCAAGTCCAAAGCCAAAACCGCCGTAT；

所述步骤S2中所述的pheSM基因是pheS基因第312位Ala突变为Gly的点突变基因：GCC312GGC。

2.如权利要求1所述一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法，其特征在于，所述步骤S1中所述的pheS基因特异引物序列为：

a：ATGGGACTAAGAGAGAAATTAG

d：TTATCCTTTCTGGTCAAATTGG。

3.如权利要求1所述的一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法，其特征在于，所述步骤S3中所述的基因插入位点是罗伊乳酸杆菌基因组中的任意位点。

4.如权利要求1所述的一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法，其特征在于，所述步骤S4中所述的pheSM基因重组罗伊乳酸杆菌具有红霉素抗性、p-Cl-Phe敏感性。

5.如权利要求1所述的一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法，其特征在于，所述步骤S5中所述的目的基因整合菌株具有p-Cl-Phe抗性，对红霉素敏感。

6.如权利要求1所述的一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法，其特征在于，所述步骤S5中所述的利用p-Cl-Phe抗性筛选目的基因整合菌株的浓度为25mM。

7.如权利要求1-6任一项所述的一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法的应用，其特征在于，在罗伊乳酸杆菌无标记基因整合中的应用。