[发明专利]一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用

说明书

本发明涉及一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用。本发明将来自Arthrobacter sp.L77菌株的麦芽寡糖海藻糖基合成酶基因、麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因和来自酿酒酵母中共价连接细胞壁的Pirlp蛋白成熟肽基因进行克隆，连接至毕赤酵母分泌表达载体pPIC‐ZαA中，构建表面展示两种酶的重组质粒pPIC‐ZαA‐MTSase‐MTHase‐Pir1p。利用α‐factor信号肽将重组蛋白引导分泌至细胞表面，麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶与Pir1p蛋白融合展示于菌体表面，实现两种酶在毕赤酵母的表面展示，从而实现双酶法生产海藻糖的高效应用。

技术领域

本发明涉及一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用，特别涉及利用毕赤酵母表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法与应用，属于微生物工程技术领域。

背景技术

海藻糖广泛分布于细菌、藻类、酵母、低等植物、昆虫和其它无脊椎动物中，是国际上最近开发的主要低聚糖之一。海藻糖可以在细胞处于饥饿、干燥、高温、高渗透压及有毒试剂等胁迫环境时，有效地维持细胞内质膜和蛋白质的稳定，在保护基因工程酶类、各种病毒、疫苗、抗体、蛋白质因子、核酸等方面取得令人振奋的结果。

目前，海藻糖制取上存在困难，因此使海藻糖的价格较高，且生产量低，远不能满足市场需求。双酶法在1991年由Lama等人首次报道，即采用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)两种酶利用淀粉为底物生产海藻糖的方法。该方法中第一种酶用来催化聚合度(DP)大于3的麦芽糊精，转化其还原端的α-1,4连接键生成α-1,1连接键。第二种酶专一性催化水解α-1,4键生成的α-1,1键海藻糖和低分子量的麦芽低聚糖。各国科学家一致认为生产海藻糖的经济方法是利用双酶法转化廉价的淀粉底物一步生成海藻糖，但近十年来产海藻糖合酶菌株难以实验发酵生产海藻糖的经济目标。

目前生产两种酶的大肠杆菌基因工程菌只能实现胞内表达，不仅需要破碎，而且在下游分离纯化时存在较多障碍。且大肠杆菌含有内毒素，生产出的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)不适合在医药食品工业使用。

毕赤酵母是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。其具有易培养、繁殖快的优点，毕赤酵母具有乙醇氧化酶基因诱导性强启动子，可调控外源基因的表达，便于基因工程操作和高密度发酵，成为微生物表面展示系统极有应用前景的宿主菌。酵母表面展示可以对外源蛋白进行折叠，糖基化修饰，利用酵母细胞内的蛋白转运机制可以将靶蛋白表达并定位到酵母细胞表面，表达的蛋白具有独立的空间构像。宿主酵母的细胞器复杂，利于真核蛋白表达，且不含内毒素和特异性病毒，对其进行高密度发酵，发酵工艺简单，成本低廉，安全可靠。

但目前尚未有成功毕赤酵母表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的报道，主要是由于两种酶同时表面展示，分子量较大，会对酵母本身产生影响，且二者表达过程中会产生影响，进而降低二者的酶反应效率。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用毕赤酵母表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法与应用。

本发明构建的表面展示工程菌可以将麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)-麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)融合酶稳定的表面展示于毕赤酵母表面的基因工程菌，菌体可以直接作为全细胞催化剂直接与底物反应，无需破碎细胞和提纯麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)-麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)融合酶，使生产海藻糖更加方便。

本发明技术方案如下：

一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法，包括如下步骤：

(1)以Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F1和R1为引物，通过PCR扩增，获得MTSase基因片段；