[发明专利]用于鉴别瘿椒树性别的引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物技术领域，涉及一种用于鉴别瘿椒树性别的引物及其应用。

背景技术

瘿椒树(Tapiscia sinensis)，又称银鹊树，属于瘿椒树科(Tapisciaceae)、瘿椒树属，为我国特有的珍稀、古老树种。由于其种子发育周期长，自然更新能力差，加上人为破坏，已处于濒危状态，被列为国家三级保护植物。

瘿椒树为雄全异株的繁育系统，在种群中有雄株和两性株两种性别。雄株开雄花不结果，两性株开完全花并结果。雄全异株在自然界中极为罕见，其在植物繁育系统的进化与维持方面具有独特的研究价值。瘿椒树的叶片内富含黄酮类化合物，具有明显的抗溃疡、解痉、抗炎及降血脂等生物活性，在医药上应用广泛。在园林绿化方面，瘿椒树树形美观，秋叶黄色，枝繁叶茂，又可作园林绿化树种。因此，瘿椒树是一种集科研、经济、观赏于一身的珍稀树种，是一种优良的种质资源。

确定瘿椒树早期的性别有助于研究雄全异株植物性别决定的遗传原理，有助于理解植物繁育系统的进化与维持。另外，不同性别的瘿椒树具有不同的经济价值，如雄株长势较两性株好，适用于园林绿化及医药有效成分的提取。两性株可以产生种子，可以用来培育幼苗扩大繁育。因此在实际应用中，根据目的的不同可选择合适的性别比例进行栽培。

雌雄异株植物性别的鉴定常从外部形态、生理生化、染色体组型、同工酶、特异蛋白质、分子标记等方面的差异来进行(李瑞丽，2006；董莉娜，2007)。关于雄全异株植物性别的早期鉴定，以及运用微卫星分子标记对瘿椒树性别鉴定，目前国内外均未见文献报道。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明提供了一种用于鉴定瘿椒树性别的引物及其应用，解决了现有技术中不易早期鉴定瘿椒树性别的技术问题。

为解决上述问题，本发明采取的技术方案为：

用于鉴定瘿椒树性别的引物，所述的引物对为TSMHF和TSMHR(TS为瘿椒树拉丁名Tapiscia sinensis的首字母缩写，M和H分别为雄性Male、两性Hermaphrodite的首字母，F为正向引物Forward首字母，R为反向引物Reverse首字母)，具体序列为：

TSMHF：5’-TTGTCCCTCTCAACTTCGCT-3’；

TSMHR：5’-AAAATCAACCAGCCAGTTCG-3’。

所述的用于鉴别瘿椒树性别的引物用于鉴别瘿椒树的雄性及两性性别的应用。

具体的，采用PCR扩增方法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法利用引物TSMHF和引物TSMHR进行瘿椒树的雄性及两性性别的鉴别。

更具体的，所述的PCR扩增方法中的PCR扩增体系包括：PCR混合液7.5μL、TSMHF 0.5μL、TSMFR 0.5μL、DNA模版20ng及H₂O 6.0μL，DNA模版为瘿椒树树叶的基因组DNA。

再具体的，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法的电泳条件为电压300V、电流100mA及时间2.5h。

进一步的，在所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法后进行银染及显影，所述的银染的染色液为质量百分比为0.2％硝酸银溶液，染色时间为15min；所述的显影的显影液包括质量百分比为0.04％的碳酸钠、质量百分比为1.2％的氢氧化钠和体积百分比为0.4％的甲醛混合溶液，显影时间为10min。

本发明的有益效果：

(1)本发明对瘿椒树的转录组序列进行测序，并运用微卫星分子标记与生物性状相关的原理，对设计的150对瘿椒树微卫星分子标记引物进行性别鉴定方面的筛选，得到1对可以用于鉴定不同瘿椒树性别的引物TSMHF和TSMHR，带型清晰、重复性好，能100％鉴别，可靠性强，可作为瘿椒树鉴定性别的引物；

(2)本方法筛选的瘿椒树性别鉴定的引物特异性极高，稳定性极强的微卫星标记引物，只需要常规PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色显影步骤，不需要进行片段分离，裸眼观察即可完成对瘿椒树性别的快速鉴定，为瘿椒树的定向育种提供理论和技术上的指导。

附图说明

图1为引物TSMHF和TSMHR扩增的10个瘿椒树个体的微卫星图谱；1-5为两性瘿椒树，6-10为雄性瘿椒树，M为核苷酸片段长度标尺；