[发明专利]一种sll0659基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用

权利要求书

1.一种sll0659基因在提高集胞藻类胡萝卜素中叶黄素、玉米黄素和α-胡萝卜素含量中的应用，所述sll0659基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，步骤如下：

（1）根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803 sll0659序列扩增集胞藻PCC6803sll0659上游cDNA片段，制得上游片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803 sll0659序列扩增集胞藻PCC6803sll0659下游cDNA片段，制得下游片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（3）将步骤（1）制得的上游片段连接入载体，用限制性内切酶BamHI 和SalI双酶切，回收载体片段1，将步骤（2）制得的下游片段用限制性内切酶BamHI 和SalI双酶切，制得回收片段2，连接载体片段1和片段2，制得sll0659BamHI载体；

（4）用限制性内切酶BamHI酶切pBluescript-Gm载体，回收庆大霉素抗性片段；将步骤（3）制得的sll0659BamHI载体用限制性内切酶BamHI酶切后，与庆大霉素抗性片段连接，制得集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除的载体pKNsll0659-Gm；

（5）将步骤（4）制得的载体pKNsll0659-Gm转化集胞藻PCC6803，经筛选，制得转基因集胞藻，经培养，即得。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，扩增引物核苷酸序列如下：

sll0659-1-F：5’-ATGAACTATGCAACTACACC-3’；

sll0659-1-BamHI-R: 5’-CGAGGATCCGGCAATGATTGGTAATT-3’。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，扩增体系如下：

2×Hifi PCR Mix 10μL，大肠杆菌基因组DNA模板1μL，正向引物sll0659-1-F 1μL，反向引物sll0659-1-BamHI-R 1μL，ddH₂O 7μL，总反应体系为20μL。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，扩增反应条件如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后；72℃10min，4℃保存。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩增引物核苷酸序列如下：

sll0659-2-BamHI-F: 5’-GCAGGATCCAATACTTTTGGGAAGCT-3’；

sll0659-2-SalI-R: 5’-CACGTCGACTCAATGGTGGAAATCGT -3’。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩增体系如下：

2×Hifi PCR Mix 10μL，大肠杆菌基因组DNA模板1μL，正向引物sll0659-2-BamHI-F 1μL，反向引物sll0659-2-SalI-R 1μL，ddH₂O 7μL，总反应体系为20μL。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩增反应条件如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后；72℃10min，4℃保存。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，载体为T3载体。