[发明专利]一种乳制品中致病菌定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品微生物检测领域，具体涉及一种食品微生物的快速检测方法，尤其涉及一种乳制品中致病菌定量检测方法。

背景技术

食品安全是一个世界性的影响人类健康的重大问题，其与人类生存环境和社会稳定息息相关。其中细菌性食物中毒的危害最为严重，感染者轻可造成发热、头痛、腹痛、腹泻和呕吐，重则会出现肌肉痉挛，甚至休克直至死亡，因此微生物的检验成为食品检测必不可少的重要组成部分，是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。通过食品微生物检验，还可以判断食品加工卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人畜食物中毒的防治措施。

据统计，目前导致细菌性食物中毒的细菌种类中，最常见的主要是沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌等等。针对这些细菌及其他易危害人体健康的食品微生物，现有的检测方法主要依赖于微生物富集培养-选择性分离-生化鉴定方法，该方法存在手工操作繁琐费时、检测灵敏度低、易出现假阴性等缺陷，且卫生指导反馈慢，给商品生产和流通带来一定的影响。此外还有常用的免疫学方法和基因探针法，前者虽能弥补传统方法的一些不足，但也有误差大、周期长的局限性；而后者也存在检测费用昂贵、实验步骤多且费时的缺点。因此研究食品微生物快速、准确、经济的检测方法以预防和控制食品安全事件的发生，具有重要的现实意义。

针对上述问题，近年来微生物学专家和工程技术人员密切合作，采用了各种物理化学及生物技术对如何快速准确经济的鉴定微生物进行了研究分析，如采用了光散射技术、发光技术、色谱技术、电气电子技术、免疫技术及放射技术等，并基于上述分析技术发明了许多定性或定量鉴定微生物的分析方法。常见的有：(1)检测某些细菌的专有酶及代谢产物进行快速鉴定；(2)应用免疫学方法检测微生物抗原或抗体，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CIA)、生物发光免疫分析(BIA)等；(3)细菌毒素的快速检测；(4)细菌对抗菌药物的敏感性试验的快速检测；(5)分子生物学技术在检测微生物中的应用，如核酸探针(Nuclearacidprobe)、聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)、基因芯片技术(microarray)等；(6)快速检测细菌生化反应及成套鉴定系统；(7)病原微生物的自动化系统，其中最有代表性的是AMS微生物自动分析系统。

目前应用最多的是采用多重PCR方法来进行食品中微生物的检测，例如杨国兴在多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性致病菌的研究中，根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵染性质粒抗原B基因ipaB、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH、单核增生李斯特氏菌的内化素A基因inlA设计了四对特异性引物，进行多重PCR反应，可同时实现对四种食源性致病菌的检测；试验过程中对多重PCR反应体系中引物添加量、镁离子浓度、dNTPmixture添加量及退火温度和循环数等影响要素进行优化，确定了适宜的多重PCR反应体系和扩增程序(参见杨国兴，“多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性致病菌的研究”，中国优秀硕士学位论文数据库，2008年6月10日)；另外，苏裕心在建立几种食源性致病菌荧光定量PCR的检测方法时，采用通过lambda噬菌体DNA标准物质候选物的制备研究，进行金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌、沙门氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌gDNA定量标准物质的制备研究；并利用SmartCycler系统建立一种高敏、特异、简便、快速的qPCR检测金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌、沙门氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌的方法，并在LightCycler2.0，ABI7300仪器上对所建立的体系进行评估(参见苏裕心，“几种食源性致病菌荧光定量PCR检测方法的建立”，中国优秀硕士学位论文数据库，2010年5月26日)。从目前的研究来看，对于食品微生物进行多重PCR检测时，主要集中在对PCR程序的改进上，其存在微观、不易操作的缺陷，并对设备和实验室的要求比较高，而且容易出现假阳性和假阴性样本。