[发明专利]彩色‑荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板（1），底板（1）的一面上顺序设有添加待测样品的加样垫（2）、标记物结合垫（3）、设有检测线T线（41）和质控线C线（42）的检测垫（4）和提供毛细管虹吸动力的吸水垫（5），相邻各垫依次搭接，标记物结合垫（3）上涂覆有彩色-荧光双功能微球标记物探针；所述彩色-荧光双功能微球标记物探针含有待测物的抗体或受体彩色-荧光双功能微球标记物和兔或鼠与待检测抗原无交叉反应的IgG彩色-荧光双功能微球标记物，待测物的抗体或受体彩色-荧光微球标记物由待测物的抗体或受体和彩色-荧光双功能微球结合制备而成，兔或鼠与待检测抗原无交叉反应的IgG彩色-荧光微球标记物由兔或鼠与待检测抗原无交叉反应的IgG和彩色-荧光双功能微球结合制备而成；

所述彩色-荧光双功能微球的制备方法为：采用微乳聚合法制备粒径为50-1000nm的聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乙烯吡啶微球、聚乙基丙烯酸甲酯微球、脂质微球和二氧化硅微球中的一种，所述微球表面带有羧基，在去离子水中加入二氯甲烷或四氢呋喃和制备完成的微球，得微球溶液，将溶于二氯甲烷或四氢呋喃的荧光标记物和脂溶性彩色颜料逐滴加入微球溶液中并密封搅拌均匀，然后解除密封并去除二氯甲烷或四氢呋喃，最后离心处理，得到彩色-荧光双功能微球。

2.根据权利要求1所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：检测线T线（41）包被有待检测抗原或配体，质控线C线（42）包被有羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。

3.根据权利要求1或2所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：所述彩色-荧光双功能微球的颜色为红色、蓝色、绿色、紫色和黑色中的一种肉眼可见的深色；荧光是稀土螯合物荧光、量子点荧光中的一种；颜色发射的波长和荧光物质发射的波长差大于等于30nm。

4.根据权利要求3所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：加样垫（2）为具有过滤作用的材质，加样垫（2）的材质为经过添加有表面活性剂、糖类、蛋白类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液浸泡预处理的玻璃纤维、聚酯膜、海绵、滤纸；

标记物结合垫（3）的材质为经过添加有表面活性剂、糖类、蛋白类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液浸泡预处理的玻璃纤维或聚酯膜；

检测垫（4）为具有强疏水特性的多孔材料，检测垫（4）的材质为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，检测线T线（41）和质控线C线（42）均至少为一条。

5.一种权利要求4的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（Ⅰ）加样垫（2）的制备

用含有EDTA、tween-20、PVP和BSA的PBS缓冲液浸泡玻璃纤维、聚酯膜、海绵或滤纸，然后置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用；

（Ⅱ）标记物结合垫（3）的制备

用含有海藻糖、牛血清白蛋白、tween-20和PVP的PBS缓冲液浸泡玻璃纤维或聚酯膜，然后置于烘箱中烘干，再将彩色-荧光双功能微球标记物探针喷涂于处理烘干后的玻璃纤维或聚酯膜上，再次置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用；

（Ⅲ）检测垫（4）的制备

检测线T线（41）的包被：将待检测抗原或配体用含有海藻糖和SDS的PBS缓冲液溶解，制得喷涂液一，将喷涂液一喷涂在距检测垫（4）左端12mm处形成检测线T线（41）；

质控线C线（42）的包被：将羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG用含有海藻糖和SDS的磷酸缓冲液溶解，制得喷涂液二，将喷涂液二喷涂在距检测垫（4）左端18mm处形成质控线C线（42）；

将喷涂好的检测垫（4）干燥保存备用；

（Ⅳ）试纸条的组装

在PVC底板（1）上依次搭接处理过的加样垫（2）、喷有彩色-荧光双功能微球标记物探针的标记物结合垫（3）、喷涂有检测线T线（41）和质控线C线（42）的检测垫（4）以及吸水垫（5），组装完毕后剪切成4 mm宽的试纸条即可。

6.根据权利要求5所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：步骤（Ⅱ）中所述彩色-荧光双功能微球标记物探针具体制备方法如下：

（a）微球的制备：采用微乳聚合法制备粒径为50-1000nm的聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乙烯吡啶微球、聚乙基丙烯酸甲酯微球、脂质微球和二氧化硅微球中的一种，所述微球表面带有羧基；

（b）彩色-荧光双功能微球的制备：在去离子水中加入二氯甲烷或四氢呋喃和步骤（a）制备完成的微球，得微球溶液，将溶于二氯甲烷或四氢呋喃的荧光标记物和脂溶性彩色颜料逐滴加入微球溶液中并密封搅拌均匀，然后解除密封并去除二氯甲烷或四氢呋喃，最后离心处理，得到彩色-荧光双功能微球，备用；

（c）待测物的抗体或受体彩色-荧光双功能微球标记物的制备：用缓冲液稀释步骤（b）制备完成的彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，于摇床上活化后，离心处理，去除上清液，加入缓冲液对沉淀复溶，然后加入与待测物相关的抗体或受体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过夜，最后离心处理，去除上清液，再用缓冲液对沉淀复溶，超声处理，制得待测物的抗体或受体彩色-荧光微球标记物；

（d）兔或鼠与待检测抗原无交叉反应的IgG彩色-荧光微球标记物的制备：用缓冲液稀释彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和兔或鼠与待检测抗原无交叉反应的抗体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过夜，最后离心处理，去除上清液，再用缓冲液复溶，超声处理，制得兔或鼠与待检测抗原无交叉反应的IgG彩色-荧光微球标记物；

（e）彩色-荧光双功能微球标记物探针的制备：待测物的抗体或受体彩色-荧光微球标记物与兔或鼠与待检测抗原无交叉反应的IgG彩色-荧光微球标记物按一定比例混合即得。