[发明专利]一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR8基因表达的方法

说明书

本发明得到天津市自然科学基金重点项目（14JCZDJC34200）“迟钝爱德华氏菌诱导的牙鲆TLRs家族免疫应答机制研究”的资助。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及用于检测牙鲆TLR8基因表达的特异性引物,更具体的说是一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR8基因表达的方法。主要用于牙鲆TLR8基因表达调控机理研究和免疫学功能研究，以及牙鲆早期病原感染的监测。

背景技术

随着世界范围水产养殖规模的扩大，国内外水产品贸易及水产苗种跨区域交流日益频繁，大大增加了水产养殖动物病原传播的机会。同时，由于现代水产养殖的集约化、高密度生产方式及渔业水域环境的恶化，又常会引发养殖动物的应激反应，导致机体的免疫系统受到抑制。正是这些因素相互影响，出现了全球性的水产养殖动物发病率趋于频繁、流行程度日益广泛、经济损失极为巨大的局面。运用现代生物技术作为水产养殖的技术支撑，掌握病害的免疫防御技术是水产科技急需解决的首要问题，因此，近年来国际上鱼类免疫学的研究逐渐受到重视。

在人类免疫学研究的历史舞台上,细胞免疫和体液免疫一直是两个主角。相比之下,固有免疫的研究由于缺乏对其相应受体的系统认识,明显滞后于获得性免疫研究的进程。20世纪90年代,Janeway等有关“病原体相关分子模式”以及“模式识别受体”概念的提出,标志着固有免疫研究进入了一个崭新的阶段。鱼类虽是低等脊椎动物，但已具备免疫的基本特性，与哺乳动物一样，其体内也存在2种免疫应答类型：固有免疫应答和获得性免疫应答。而相对于哺乳动物来说，鱼类的固有免疫研究才刚刚起步。

Toll样受体（Toll-likereceptors，TLRs）家族是动物识别入侵病原体的主要“模式识别受体”，可识别几乎所有病原生物的一些通用结构，是启动固有免疫应答的关键。一般认为TLR1、2、4、5和6主要参与细菌成分的识别，而TLR3、TLR7和TLR8主要特异地针对病毒成分，TLR9对这二者均能够识别。TLR14、21～23在某些鱼类中存在，在哺乳动物中还未发现。

牙鲆(Paralichthysolivaceus)在我国俗称牙片、偏口、比目鱼，是我国北方海水工厂化养殖的主要名贵鱼类品种，同时也是重要的海水增养殖鱼类之一。牙鲆属于鲽形目，鲆科，牙鲆属。牙鲆属的鱼类在南、北美洲东西岸较多，而亚洲沿岸只有牙鲆一种，主要分布于渤海、黄海、东海、南海以及朝鲜、日本、俄罗斯沿岸海区。近年来，腹水病、病毒性神经坏死症等各种病害的爆发和流行给生产企业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了牙鲆养殖产业的发展。腹水病在牙鲆疾病中危害最为严重,该病从苗种到成鱼均有发生,死亡率可达50%-80%。由于目前对牙鲆免疫机理和机制的了解较少，尚无有效的免疫防治技术和治疗方法。

TLRs是宿主免疫的必需分子之一,通过感知病原微生物体，识别病原相关分子模式，激活天然免疫系统，TLR8作为TLRs家族的成员，参与鱼类免疫调节，在一定程度上反映了鱼类的免疫能力，因此可以作为鱼类疾病防治中免疫监测的指标，同时，揭示牙鲆TLR8的免疫学功能及作用机理，也将为寻找鱼类病害防治的新策略提供理论依据，具有潜在的应用价值和社会效益。

实时荧光PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。目前，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，近年来，实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中也得到了广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是公开一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR8基因表达的方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下:

设计一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR8基因表达的特异性引物，其特征在于包括符合荧光PCR反应特点的特异上下游引物：TLR8-q-F：5'-AGTTTCACCCGCAGATTG-3'；TLR8-q-R：5'-CTGGGATGCCTCCTATGT-3'；

以及作为内参基因的牙鲆β-actin特异上下游引物：β-actin-F：5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3';β-actin-R：5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3'。

本发明所述特异性引物快速检测牙鲆TLR8基因表达的方法，其特征在于按如下步骤进行：