[发明专利]一种特异性标记的辣椒素荧光探针及其合成方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种特异性标记的辣椒素荧光探针及其合成方法和应用。

背景技术

蛋白质的结构、运动和功能对生命体的运动有着十分重要的意义。研究蛋白质的结构及动态学的手段包括荧光光谱、核磁共振、电子显微镜、X射线晶体衍射等。其中，蛋白质的荧光检测法具有标记位点方法灵活、灵敏度高、检测方法简便等优势得到广泛应用。然而，目前全世界仅有少数机构具备能力采用荧光标记配体探针来研究离子通道结构功能的动态过程，其技术原理是在配体特定位点标记上荧光探针，并明确该荧光标记探针仍然具有功能。随后，通过检测该探针与受体膜蛋白之间的结合和解离效应，实现解析该通道蛋白激活和失活的动态过程。目前，这种荧光标记技术尚处于该领域前沿，已经越来越受到广泛关注。

TRPV1通道又被称为辣椒素受体，是一个配体门控的非选择性阳离子通道，可以被各种外因性及内因性的物理及化学刺激所激发，已经发现广泛表达于中枢神经系统及末梢神经系统上，涉及温觉、痛觉的传递和调制以及整合各种疼痛信息等重要的生理功能。已知主要的TRPV1内源性配体为辣椒素，它本身不具备荧光特性，且目前尚无辣椒素类荧光配体，无法对TRPV1通道的激活和失活等门控过程进行可视化动态研究。

发明内容

为了解决目前TRPV1通道蛋白缺乏特异性荧光探针配体的问题，本发明将7-硝基苯并呋咱(NBD)荧光基团引入TRPV1的特异性配体辣椒素类似物，成功合成了一种新型的特异性标记的辣椒素荧光探针。

首先，本发明公开了一种特异性标记的辣椒素荧光探针，结构如式(Ⅲ)：

其中，R＝(CH₂)₂,(CH₂)₃,(CH₂)₄,(CH₂)₅,(CH₂)₆,(CH₂)₇,(CH₂)₈,(CH₂)₉,(CH₂)₁₀或(CH₂)₁₁。其激发波长在450-480nm之间，发射波长在510-540nm之间。

由于NBD荧光基团在脂溶性坏境中的荧光强度显著强于水溶性环境，该特征可显著增强目标化合物与膜蛋白受体TRPV1结合时的荧光强度。

其次，本发明还提供了特异性标记的辣椒素荧光探针的合成方法。合成路线如下式所示，将化合物I和化合物II在HOBT，DCC，DMAP催化下在有机溶剂中缩合而成。

其中，R＝(CH₂)₂,(CH₂)₃,(CH₂)₄,(CH₂)₅,(CH₂)₆,(CH₂)₇,(CH₂)₈,(CH₂)₉,(CH₂)₁₀或(CH₂)₁₁。

所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、二氧六环、丙酮、氯仿、二氯甲烷、甲醇和乙醇的一种或多种，或上述溶剂的任意比例混合，优选为N,N-二甲基甲酰胺。

优选的，具体方法为：取1当量化合物Ⅰ与1当量化合物Ⅱ，溶于DMF中，加入1当量的HOBT、1当量的DCC、0.1当量的DMAP，室温搅拌24小时；除去有机溶剂，柱层析，用二氯甲烷：甲醇＝10：1洗脱，得到相应的化合物Ⅲ。

另外本发明还提供了特异性标记的辣椒素荧光探针用于TRPV1通道蛋白的特异性荧光标记的用途。