[发明专利]一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于稀有细胞检测领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

人外周血中的循环肿瘤细胞是存在于肿瘤患者外周血中的一类数量稀少却具有重要临床意义的稀有细胞，它是由肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。血液中的循环肿瘤细胞提示了体内肿瘤的存在以及可能的转移，而临床上超过90％的癌症死亡都是由转移造成的，同时血液中的循环肿瘤细胞提供了体内除了肿瘤病灶以外的肿瘤细胞的来源，因此从血液中捕获并检测循环肿瘤细胞越来越引起人们的重视。

循环肿瘤细胞在外周血中含量极少，每10ml血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有多达约1亿个白细胞和500亿个红细胞，因此从外周血中快速、高效的检测循环肿瘤细胞是此领域面临的挑战。目前唯一获得美国FDA批准的循环肿瘤细胞检测试剂盒是用于CellSearch^TM系统的试剂盒，被批准应用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者的预后评估与生存期预测(CristofanilliM,BuddT,EllisMJ,etal.N.Engl.J.Med.2004,351,781-791；RiethdorfS,FritscheH,MullerV,etal.Clin.CancerRes.2007,13,920-928；CohenSJ,PuntCJA,IannottiN,etal.J.Clin.Oncol.2008,26,3213-3221)，这一系统运用标记有针对EpCAM抗体的磁性颗粒进行血液中循环肿瘤细胞的捕获，但其捕获效率较低，存在大量白细胞的非特异性吸附，且需依赖大型、昂贵的设备。

微流控芯片是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块芯片上，自动完成分析全过程。微流控芯片的基本结构是比较简单的，就是在基板(通常是PDMS)上加工出微通道，然后将盖片和基片键合到一起，以形成封闭的微流体通道。基于微流控芯片的循环肿瘤细胞富集检测方法是近年来出现的新技术，通过将识别循环肿瘤细胞的抗体修饰在盖片的表面，并通过一定的几何设计使流过芯片的细胞与负载抗体的表面有充分的接触，因此来确保循环肿瘤细胞能够被捕获，达到较高的捕获效率。已报道的用于捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片包括微柱阵列型芯片(NagrathS,etal.,Nature2007,450,1235)、具有交错式混合结构的“鱼骨型”芯片(StottSL，etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107,18392；WangS.etal.Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,3084)、HTMSU芯片(AdamsAA,etal.J.Am.Chem.Soc.2008,130,8633)以及Nano-Velcro芯片等。其中具有交错式混合结构的“鱼骨型”分离速度快，捕获率与富集纯度均较高，富集到的循环肿瘤细胞的活性也高于其他常规技术，因此受到临床以及技术研究领域的高度重视。

“鱼骨型”芯片由具有交错式混合结构的PDMS基片与载玻片键合而成，其中PDMS基片中的交错式混合结构是一组经过设计的周期性的凹凸结构，用于打破微流体通道内的层流，使其中的细胞能够与各壁面接触。传统的“鱼骨型”芯片存在两个缺点：(1)由于PDMS基片本身难以进行稳定的化学修饰，因此以往的“鱼骨型”芯片只将抗体负载于底部的载玻片上，因此能够捕获循环肿瘤细胞的区域只涉及微流体通道的底部；(2)载玻片上抗体的负载有两种方法，一是将抗体直接修饰与载波片上，二是先将亲和素修饰与载玻片，待实验是加入生物素标记的抗体，但无论是在载玻片上负载抗体还是亲和素都需要将“鱼骨型”芯片低温保存，且保质期一般只有几周。

发明内容

本发明提供了一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用，用以解决目前检测试剂盒捕获效率低、保质期短等问题。