[发明专利]消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系及扩增方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及分子诊断技术领域，具体涉及一种消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系及扩增方法和应用。

背景技术

依赖解旋酶恒温扩增技术(helicase-dependent amplification,HDA)是一种有效的指数扩增目标核酸的技术。该技术模拟生物体内核酸复制过程，利用DNA解旋酶在等温条件下解开双链DNA，用单链结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein)维持DNA单链状态，继而在DNA聚合酶的参与下实现核酸扩增，无需类似于PCR所要求的复杂而精确的热循环(变性－退火－延伸)过程。HDA已被认为是一种强有力的PCR的替代方法，特别是在资源有限的地区和需要实地检测等情况下，HDA展示了卓越的简便性和实用性，如今已被广泛应用于病原体检测和SNP分型。

早期HDA在较低的温度(约37℃)下进行，利用大肠杆菌UvrD解旋酶和另外两种辅助蛋白MutL和单链结合蛋白来实现扩增反应。为了进一步提高HDA的反应效率，许多研究人员作了不懈努力。Kong的课题小组从嗜热厌氧杆菌中克隆和纯化出一种热稳定UvrD解旋酶(thermostable UvrD helicase)来在更高的温度(60～65℃)下实现HDA反应，在无辅助蛋白体系内实现高效扩增。另外一种HDA改进方法通过使用一种由解旋酶和DNA聚合酶融合而成的双功能蛋白，能成功实现更长片段(2.3kb)的扩增。还有课题小组提出在扩增之前用内切酶处理目标基因组DNA可加快HDA的速度和提高其灵敏度。另外，也有人研究得出：引物的5’端富含A或者C比含T或者G有利于得到更有效的扩增反应。尽管如此，引物二聚体依然存在。这个常见的问题干扰了目标核酸链的特异性积累，产生了错误的检测结果。

最近，Zhang的课题小组报道一个新型的目标转换的HDA检测方法消除了引物二聚体的干扰，实现对转录因子的超灵敏检测。在整个HDA扩增反应中，他们仅使用单个引物，此引物与精心设计的发卡结构模板的茎互补，消除了传统HDA中引物对构成的引物二聚体造成的非特异性扩增。然而，此方法额外使用外切酶完全消化未与目标物结合的发卡模板并需要对外切酶进行加热灭活以防止背景信号产生。再者，由于此方法基于给定的发卡模板，不能用于其他核酸链的扩增以及各种非核酸目标物的检测。

目前为止，还没有简单通用的方法能够完全消除引物二聚体造成的背景。随着HDA应用范围的扩大，亟需发展一种通用而简单的方法来进一步改善HDA的应用。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系及扩增方法和应用，该方法简单实用、通用性强、效果好；该体系能够实现零背景的HDA。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系，该体系包括：2.5μL的10×退火缓冲液II，1μL的100mM MgSO₄、2μL的500mM NaCl、1μL的5μM反向引物、1μL的5μM正向引物、1μL的52.5mM ATP溶液、1μL的3.5mM dNTPs、0.75μL的酶混合物及1μL的5×SYBR Green I。

优选地，选取40bp的链作为模板链，则以模板链5’端的18个碱基相同的18bp的链作为正向引物，以与模板链3’端24个碱基互补的24bp的链作为反相引物。

本发明还公开了一种消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖扩增方法，包括以下步骤：

1)根据待扩增的目的片段模板设计引物，包括正向引物和反向引物；

2)构建HDA反应体系，包括：正向引物、反向引物、模板、缓冲液、反应所需的酶以及ATP和dNTPs；

3)将体系中各个反应物混合均匀，进行HDA等温扩增，根据荧光信号检测扩增结果，判断实现零背景旋酶依赖扩增反应。

步骤2)所述的HDA反应体系参照标准的HDA反应体系，对ATP和dNTPs浓度做调低处理。

步骤3)所述的荧光信号检测扩增是采用96 System进行实时荧光检测，每60s测定一次，设定温度为60℃。

所述的模板为合成的单链或经过细胞端粒酶扩增之后的单链。

优选地，消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖扩增方法，包括以下步骤：

1)根据模板序列，设计正向引物和反向引物：