[发明专利]一种分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种由双向电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法。

背景技术

硫酸铵分级沉淀和柱层析法是传统的分离谷胱甘肽过氧化物酶的方法，硫酸铵沉淀法的原理是高浓度的硫酸铵离子在蛋白溶液中与蛋白竞争水分子，从而破坏蛋白表面的水化膜，降低其溶解度并使之从溶液中沉淀出来，因此可利用不同浓度的硫酸铵溶液沉淀溶解度不同的蛋白；柱层析法的原理是蛋白样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次分配后可将不同蛋白分离。这2项技术原理简单但实验过程繁琐复杂，不仅需要专门的实验设备和仪器，且分离蛋白时间超长，不能实现蛋白纯化和蛋白批量化，因此有待探索新的实验技术和方法。

Farrell于1975年首次建立了等电聚焦—聚丙烯酰胺双向凝胶分离和分析蛋白质组的技术，并使用该技术成功分离了约1000个蛋白质。这就是后来的二维双向凝胶电泳技术(Two-dimensionalgelelectrophoresis)，并于20世纪70年代初广泛应用，随着该技术的不断成熟和完善，其分离蛋白质的精度和特异性越来越高。操作二维双向凝胶电泳时首先进行等电聚焦，使待分离的各个蛋白按各自的pH梯度分离，至各自的等电点处，再沿垂直方向按蛋白质分子量的不同进行分离。双向凝胶电泳技术因其原理简明，操作简单，分离精准，能批量分离并纯化蛋白等特点已能够应用于分离蛋白质组中所有蛋白，如结合质谱鉴定技术，还能实现蛋白质鉴定等诸多功能。

酶蛋白是蛋白家族中种类最为丰富的一类蛋白，利用二维双向电泳技术也可以实现酶蛋白精确的分离和纯化，谷胱甘肽过氧化物酶是一类参与逆境调解的酶蛋白，是植物体内清除活性氧的重要酶类，能保护生物膜、蛋白质免受活性氧损伤，并具有提高植物抗性的生理功能。因此如能从众多酶蛋白中单独分离提纯出谷胱甘肽过氧化物酶，就可进一步用于该酶的活性研究、氧化还原与清除氧自由基机理研究、抗逆机制研究、抗逆基因克隆、差异蛋白质组学的相关研究等。因此本发明利用二维双向电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶。

利用二维双向电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶，和传统的分离技术相比，双向电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶过程中，经过二次电泳后可将该酶蛋白充分分离，提高了蛋白分离的效率和精准度；双向电泳技术还可实现平行泳道多次加样和平行样品重复实验，因此能一次性得到一定数量的纯化酶蛋白，可为其他科学实验提供充足的酶蛋白样品；该方法在实验过程中共经过了3次纯化蛋白的操作，保证了所分离的酶蛋白的高纯度，可用于对酶蛋白的质量和纯度要求很高的底物与蛋白互作等高层次的科学研究，这是传统的蛋白分离技术所无法比拟和实现的。

发明内容

本发明提供在金山绣线菊中分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法，利用二维双向凝胶电泳技术，通过凝胶扫描和图像分析、胶内蛋白酶解等技术，建立在金山绣线菊中分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的技术体系，与传统的提取该酶蛋白的方法相比，利用双向电泳技术与方法分离纯化蛋白具有更高的精确性、可操作性和先进性；该技术方法分离纯化的蛋白具有更高的纯度、更多的数量和更优的科研价值。

由二维双向电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法，按以下步骤进行：