[发明专利]通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法

权利要求书

1.通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)在铁调素基因第一个外显子和内含子之间设计gRNA序列，gRNA序列为CCAAGCGCCAAGTCACCTTTCC；

(2)设计并合成gRNA引物，引物序列为P3:Forwardsequence(5’to3’):TAACGTGTTTCTGGCTGCTG,

P4:Reversesequence(5’to3’):AAAAGCACCGACTCGGTGCC；

(3)以上述的引物、gRNA-plasmid为模板进行PCR反应，

PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环：95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共30个循环，然后72℃-10min，最后保温在16℃；电泳检测PCR产物后，进行纯化；

(4)RNA-Free条件下，将上述的PCR产物进行体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7聚合酶和NTP，37℃，1hour反应完毕，然后进行纯化；

(5)将前述纯化后的gRNA和Cas9蛋白显微注射到单细胞的斑马鱼胚胎中，24小时后提取DNA进行测序检测；

(6)3-4个月后斑马鱼性成熟后，将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，得到一定概率的杂合子，将胚胎进行RNA提取并逆转录成DNA送测序查看是否有突变，这时候的DNA还是双链的；

(7)将测序后发现突变的斑马鱼的cDNA和19T载体相连接后，将其在培养基中滚珠图板，经过12-14小时后，已经连接的质粒会以斑点形式成长，将其挑斑后，这时候得到的是单链的DNA，再次送测序，最终得到单链的突变，这时候为真正杂合的突变体，然后将其培养长大；

(8)经过3-4个月后性成熟后，第二代的突变成年的雄鱼与雌鱼再次切除尾巴，进行鉴定，突变的斑马鱼再次交配，从而得到纯合的铁调素敲除的斑马鱼。

2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于，所述步骤(3)中PCR的酶为KOD酶。

3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于，所述步骤(3)中gRNA-plasmid的制备方法如下：

(1)设计并合成gRNA引物，引物序列为P3:Forwardsequence(5’to3’):TAACGTGTTTCTGGCTGCTG,

P4:Reversesequence(5’to3’):AAAAGCACCGACTCGGTGCC；

(2)以上述引物及斑马鱼cDNA为模板进行PCR反应，

PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环(95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共30个循环)，然后72℃-10min，最后保温在16℃；

(3)RNA-Free条件下，将上述的PCR产物进行体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7载体和NTP，37℃，1hour反应完毕，然后纯化，得到gRNA-plasmid。

4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中的纯化方法包括如下步骤：

(A)加入体积为1：2-3的水和苯酚/氯仿/异丙醇,混匀后10,000-15,000rpm离心5min.上层移入新的管子，重复该步骤一次，

(B)上层移入新的管子，加入150ul氯仿,离心5min，

(C)加入1/10体积2.5M醋酸钠以及2.5体积乙醇,-70℃冷冻30min.

(D)离心10,000-15,000rpm在4C15min，

(E)弃掉溶液留沉淀，加入200ul80％乙醇,离心5min.弃掉溶液，干燥后用10-20μlDEPCH₂O溶解。

5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于，所述步骤(5)中注射体系为：gRNA12.5(ng/ul)，Cas9为300(ng/ul)，Tris-Hcl0.2ul，Phenol-red0.2ul，DEPCWater补充到2ul。