[发明专利]一种基于酸敏感修饰核苷酸的DNA测序方法

说明书

技术领域

本发明属于化学合成和生物化学领域，涉及可用于DNA测序的化合物，具体涉及一种基于酸敏感修饰核苷酸的DNA测序方法。

背景技术

DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNAsequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。

合成法测序(SequencingBySynthesis，SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制四种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。

在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，即可逆终止剂(reversibleterminator)。这类核苷酸除了要求3’-羟基阻断外，为了不影响下一个标记核苷酸的延伸和识别，还要求通过一个可剪切的连接单元把核苷酸和荧光素连接起来。然后，在下一个标记核苷酸延伸之前，在温和的条件下将标记的荧光素完全剪切，以便下一个标记核苷酸继续能够参与DNA链延伸，从而读出碱基序列。该连接单元对测序的读长和效率有非常重要的影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，以便提高DNA测序的效率。

可剪切连接单元对DNA测序的读长和效率有重要的影响，而现有的连接单元存在剪切条件不够温和、效率不高，用于测序时读长太短等缺点，因此，设计、合成新的连接单元，并探索合适的剪切条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。

现有技术中常常采用的二硫键可逆终端dUTP-SS-TAMRA，在连续多个碱基A的模板时，一次可延伸两个可逆终止剂，而无法保证一次延伸反应只延伸一个可逆终止剂。目前在本领域中，为了确保一次只延伸一个可逆终止剂，往往都需要使用3′-OH保护的修饰核苷酸。然而，3′-OH保护的修饰核苷酸合成复杂、产率低，产物纯化困难；而且在实际测序过程中，使用3′-OH保护的可逆终止剂进行延伸时，需要将两个反应位点同时断裂，即，将荧光素100％剪切的同时也需要以100％效率将3′-OH去保护。但在测序过程中，这两个位点往往不能同时剪切，或者剪切反应并不完全，这势必导致测序过程中的错误被累积，最终影响测序的读长和效率。

综上所述，本领域迫切需要一种准确性高，特别是在模板为连续多个相同碱基时能够具有很高的延伸效率和剪切效率的DNA测序方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种准确性高，特别是在模板为连续多个相同碱基时能够具有较高的延伸效率和剪切效率的延伸方法。

本发明涉及一种DNA测序方法，所述方法包括：

(a)用式(I)所示的酸敏感修饰核苷酸为可逆终止剂，参与DNA链延伸反应以及

(b)对所述酸敏感修饰核苷酸中的酸敏感连接单元进行断裂；

其中，

所述荧光素选自：BODIPY、罗丹明、香豆素、咕吨、花青、芘、酞菁、Alexa、Squaring染料、产生能量转移染料中的一种或几种的组合；

所述Base(碱基)表示选自如下碱基：U、T、C、A或G。

优选的，所述荧光素选自：Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、FITC、TexasRed-X、AF594、Bodipy-FL、R6G、ROX、Bodipy-650、AlexaFluor594、DyLight594、AlexaFluor647、DyLight649、AlexaFluor546、DyLight549中的一种或几种的组合。

优选的，所述酸敏感修饰核苷酸选自：

优选的，步骤(a)中，所述DNA链延伸反应中所用的酶包括Klenow、9°N或Theminator。

优选的，步骤(b)中，所述断裂所用的酸包括稀盐酸、稀硫酸或各种lewis酸。

优选的，步骤(b)中，所述断裂的断裂温度为25℃～60℃。更优选为37±2℃。

优选的，步骤(b)中，所述断裂在pH为2～5下进行。

优选的，步骤(b)中，所述断裂的断裂时间为0.5～10min。更优选为1～3min。