[发明专利]一种鉴定马蹄莲软腐病抗性的离体叶盘接菌方法

权利要求书

1.一种鉴定马蹄莲软腐病抗性的离体叶盘接菌方法，其特征在于，每个被鉴定品种或谱系随机挑选三份成熟健康的叶片，清洗消毒后首先在叶片中上部以主脉为中轴用打孔器获取直径为1.5cm的叶圆盘，重复取12次；之后利用注射器沿叶圆盘的主脉下部注射100μl胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种细菌悬液，并将其浸泡在包含10ml胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种细菌悬液的12孔培养板中；同时再将其放置在生化培养箱中28℃恒温培养，期间用无菌水补充1次，60小时后将鉴定材料取出，目测观察叶盘发病面积并根据分级标准进行分级；计算病情指数，最后依据计算的病情指数确定各品种或谱系的抗感特性变异情况。

2.根据权利要求1所述的离体叶盘接菌方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种细菌悬液的制备

将胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种接种于肉汁胨(NA)平板培养基上，28℃培养，挑取平板上的单菌落接种到LB培养基中，在37℃恒温培养箱中进行活化并扩大培养24h，4000rpm离心10min，弃上清，菌体沉淀中加入无菌水配制成胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种细菌悬液；

(2)参试品种的叶片处理

选取15个马蹄莲品种或谱系，每个品种选三份健康成熟的叶片，清洗晾干后用75％的酒精消毒；之后在叶片中上部以主脉为中轴用打孔器打出包含叶主脉的直径为1.5cm的叶圆盘，每个品种重复取12次；

(3)接种鉴定

对12份叶圆盘分别利用注射器沿其下部主脉分别注射100μl胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种细菌悬液，以上部有液体溢出为宜；之后将其分别放置在含有10ml胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种细菌悬液的12孔培养板中，将培养板放置于28℃生化培养箱中进行培养，期间为防止蒸发加无菌水1次；

(4)抗性观察和评价

在接种60h后将12孔板取出，在LED灯箱上目测法观察并记录每个叶盘感病(水渍状)面积/圆叶片总面积的值，按照分级标准进行分级并计算病情指数，最后依据计算的病情指数确定各品种或谱系的抗感特性变异情况。

3.根据权利要求1或2所述的离体叶盘接菌方法，其特征在于，所述的胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种细菌悬液的浓度为1×10⁸cfu/mL。

4.根据权利要求1或2所述的离体叶盘接菌方法，其特征在于，所述的分级标准为：0级，叶盘无或较少的病状，0＜病斑面积/总面积≤10％；1级，10％＜病斑面积/总面积≤30％；2级，30％＜病斑面积/总面积≤50％；3级，50％＜病斑面积/总面积≤70％；4级，70％＜病斑面积/总面积。

5.根据权利要求1或2所述的离体叶盘接菌方法，其特征在于，依据计算的病情指数确定各品种或谱系的抗感特性变异情况是指：病情指数≤20为“高抗”；20＜病情指数≤40为“抗病”；40＜病情指数≤60为“中抗”；60＜病情指数≤80为“感病”；80＜病情指数为“高感”；