[发明专利]烟曲霉实时PCR技术

说明书

近20多年来，由于艾滋病患者的增多，新的治疗技术和骨髓移植、器官移植和强化化疗等广泛应用于临床，侵袭性真菌病的发病率明显升高，严重危害人类健康，甚至危及生命，大大增加了临床治疗的难度，已引起广泛高度重视，本实验室建立了一种针对烟曲霉进行特异性检测的荧光定量PCR方法(探针法)，该PCR检测体系的检测敏感性方面，线性检测范围的下限可至10²copies/ml，上限可达10⁸copies/ml，敏感性、特异性和稳定性均较好。

本申请是分案申请，母案的申请日为2013年8月15日，申请号为201310355569.5，发明名称是烟曲霉实时PCR技术。

技术领域

近20年多年来，由于艾滋病患者的增多，新的治疗技术和骨髓移植、器官移植和强化化疗等广泛应于临床，侵入性检测设备，胃肠外营养，光谱抗生素的长期应用以及危重患者辅助机械通气代替治疗、老龄人口的增多等原因，侵袭性真菌病的发病率明显升高，特别是一些免疫功能低下患者如恶性肿瘤病人继发感染以及器官移植失败等医院内感染问题常常由真菌感染所致，严重危害人类健康，甚至危及生命，大大增加了临床治疗的难度，已引起广泛高度重视，Chandrasekar等人报道了造血干细胞移植的患者移植后出现侵袭性真菌病的患病率大于30％，而移植后因感染IFD而死亡的比率高达70％-90％，IFD的早发现早治疗对于改善患者预后具有重要意义，而当前实验室内的常规检测方法由于其敏感性和耗时性等缺陷，难以满足临床的需求，亟需寻求一种更加灵敏和特异的检测方法，为目前临床真菌感染的早期诊断、预防和治疗提供有效工具。随着近年来对真菌病原研究的不断深入，使人们重新看到了真菌PCR在临床应用的曙光，本课题组大胆求索，建立了一种针对烟曲霉病原菌进行检测的实时PCR法。

背景技术

侵袭性真菌感染(IFD)十分普遍，主要由念珠球菌属、曲霉属、隐球菌属等机会致病真菌(或条件致病真菌)引起，也可由组织胞浆菌、皮炎牙生菌、孢子丝菌等地方流行性致病真菌所致，其中曲霉菌属已成为免疫低下患者二次感染的重要致命因素，IFD的早期诊断和早期治疗对于改善病人预后有着重要意义，而当前真菌感染的特点是高院内感染率、低实验室诊断率、低临床诊断率和病情进展迅速，传统诊断方法包括深部组织培养法、组织/细胞病理学检测、1-3-β-D葡聚糖(G试验)、半乳甘露聚糖检测(GM试验)和影像学检查(如CT)等，由于它们在敏感性、特异性等方面存在缺陷，难以满足临床早期诊断的需要，如何提高IFD的早期诊断、早期治疗是国内外学者关注的热点问题，所以近年来IFD的早期诊断方法的研究被广泛开展，虽然当前仍处于实验室研究阶段，但其应用前景广阔，值得期待。

发明内容

将烟曲霉线粒体基因组大小为30696bp，将其基因组序列在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi数据库中进行比对，找到特有的靶序列部分，在靶序列上设计一对，上游引物：5'-CTTGAATACTTCAGTAACT-3'，下游引物5'-CCTCTATTTACTAAATCATC-3'；探针5'FAM-GCAAGGCGAT TTATC TCACC ACT-3'TARMA，靶片段长度132bp。具体靶序列cttgaatac ttcagtaact attagtaata tgttattaga ttctgatatatatcataatc atatagatag aagaataata atgatacaaa gtggtgagat aaatcgcctt gctgatgatttagtaaatag agg(132bp)。