[发明专利]用于敲除人BTF基因的gRNA序列及其敲除方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明涉及在细胞水平稳定敲除BTF（Bcl-2-associated transcription factor 1）基因。

背景技术

BTF是KASOF等利用酵母双杂交系统寻找病毒抗凋亡蛋白E1B 19K相互作用蛋白时新发现的，位于染色体6q21-23区段，该区段稳定性较差，在多种肿瘤中易发生染色体的缺失。BTF在多种上皮组织均存在较强的表达，如骨骼肌、胎盘、心、脑、肺、肾及胰腺；在肿瘤细胞HeLa S3、白血病细胞HL-60、K-562、MOL74、结肠腺癌SW480、肺癌细胞A549及巴金氏淋巴瘤细胞Raji均表达。

BTF具有basic zipper-like（位于110 -126aa）、Myb-like（位于522 -531aa）DNA结合结构域，在正常非凋亡细胞，BTF位于细胞浆，而在凋亡细胞或死细胞BTF位于细胞核可能发挥其转录因子的功能，激活凋亡相关基因表达。研究表明E1B19K、Bcl-2及Bcl-xL与BTF存在相互作用，它们可以抑制BTF转运入细胞核，而停留在细胞浆，消除其转录活性。在DNA损伤反应中，PKCδ磷酸化BTF，PKCδ/BTF结合于CEP元件，激活下游靶基因P53的表达，从而发动细胞凋亡及细胞生长阻滞。在依托泊苷诱导的DNA损伤反应中，转录因子 Bcl-2-associated transcription factor 1（BTF or BCLAF1)激活下游靶基因P53的表达，从而发动细胞凋亡及细胞生长阻滞。YY Lee等研究表明高剂量放射（10Gy）可以促进BTF与γH2AX共聚集，抑制DNA双链断裂(double-stranded breaks,DSBs) s的损伤修复，增强CEP-P53表达，促进细胞凋亡。BTF-/-敲除小鼠的研究表明BTF在肺发育及免疫系统稳态中发挥调节细胞凋亡的作用。在肺囊形发育阶段，BTF表达非常强，是平滑肌时间、空间正确排列所必须的，但在肺发育晚期BTF不表达。

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）是一系列成簇排列的DNA序列，被称作“规律间隔成簇短回文重复序列”，是细菌中一种对付诸如病毒等外来DNA的防御系统。Cas基因编码的蛋白包含核酸酶、聚合酶、解旋酶以及与核糖核酸结合的结构域。CRISPR 转录出的 RNA与Cas蛋白结合形成核糖核蛋白复合物协同行使CRISPR/Cas系统的免疫功能，来对Cas蛋白起到导向作用，因此这段RNA也被称为单链导向RNA（singleguide RNA，gRNA）或者是导向RNA（guide RNA）。当复合体检测到入侵的DNA和gRNA序列一致时，Cas蛋白就能够切割入侵的DNA，达到防御的目的。只需针对需要编辑的DNA序列合成一段导向RNA的DNA序列，在转入宿主细胞后，产生的人工构建的gRNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列，从而起到基因编辑的作用。

发明内容

本发明的第一方面是提供一种用于CRISPR/Cas9敲除人细胞BTF（Bcl-2-associated transcription factor 1）基因的gRNA的靶DNA序列，所述序列如SEQ ID NO: 1所示。

本发明的第二方面是提供一种采用上述DNA序列敲除人细胞BTF（Bcl-2-associated transcription factor 1）基因的方法，具体步骤如下：

（1）人工合成所述DNA序列及其互补链；将核酸片段插入到gRNA克隆质粒并通过大肠杆菌TOP10转化，挑单克隆菌株，提取质粒，测序鉴定；

（2）分别将gRNA克隆质粒及hCas9质粒转化入大肠杆菌TOP10，培养过夜，提取细胞转染质粒；

（3）将转染细胞培养基换为无血清培养基，将gRNA克隆质粒及hCas9质粒用培养基配制成转染混合液，加入到转染细胞培养基中，5-6小时后，转染细胞培养基替换为血清培养基继续培养2-3天，即得敲除BTF基因的转染细胞。

本发明的第三方面是提供所述DNA序列在敲除BTF基因中的应用。

具体实施方式

实施例1CRISPR/Cas9 BTF-guide RNA质粒构建、细胞转染及突变鉴定

（1）CRISPR/Cas9 BTF-guide RNA质粒构建