[发明专利]一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体及其制备方法与应用

说明书

通过生物信息学预测牛源化抗体重、轻链可变区的8个FR，并植入抗独特型单链抗体A12的6个CDR来确定牛源化改型抗体的序列，进行人工合成，从而构建A12的牛源化的改型抗体bovine‑A12‑PUC57，并通过替换易于噬菌体表达的PIT2载体，获得牛源化改型抗体bovine‑A12‑PIT2。ELISA分析表明牛源化改型抗体bovine‑A12‑PIT2与小菜蛾中肠BBMV具有一定的结合能力，生物活性验证表明其具有一定的杀虫活性。本发明利用生物信息学预测和人工合成的方法可快速高效的地获得动物来源的改型抗体（杀虫蛋白资源）。使用这些基因工程抗体技术探索开发新型且安全性高的杀虫蛋白资源的可能性，也为发展新型杀虫白提供了新的思路和方向。

技术领域

本发明属于微生物农药领域，特别是一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体及其制备方法与应用。

背景技术

来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)的Bt毒素蛋白是目前最为有效的抗虫资源，但经报道的新高效株系越来越少(Bravo et al., 2013；Bravo etal., 2011)而Bt毒素使用量增加使其在害虫抗药性及次生害虫上升等方面存在生态风险，这一现状促使高特异活性和新功能类的Bt毒素抗虫资源的积极开发(Bravo and Soberon,2008；Pigott et al., 2008)。因此，模拟Bt毒素杀虫蛋白的筛选，开发其它类型的杀虫蛋白，尤其是安全性更高的蛋白资源，是解决这些问题的有效途径之一。

独特型抗体（Anti- idiotypic antibody, Anti-Id）理论以及人源化的抗体库筛选技术可以获得具有模拟特定抗原（Bt Cry毒素）结构及功能的肽活性材料,目前所公开的模拟的Bt Cry毒素包括：Cry1Ab（公开号为CN103773774A的中国专利）、Cry 1B（公开号为CN103773775A的中国专利）、Cry 1C（公开号为CN103773776A的中国专利）、Cry 2A（公开号为CN104498501 A的中国专利），经过测鉴定，这些人源化的Cry毒素Anti-Id都具有一定的杀虫活性，由此可见，抗独特型抗体制备技术是开发新型杀虫蛋白的一个新途径。

抗体分子可以分为轻链（light chain）和重链（heavy chain）两部分，而轻链和重链又分别可以分为可变区（variable region, V区）和恒定区（constant region, C区）。抗体分子的恒定区是决定抗体分子结构中免疫原性的部位，而抗体的可变区则决定了抗体分子的特异性。轻链可变区（light chain variable，VL）或者重链可变区（heavy chainvariable，VH）都是由4个骨架区（framework region，FR）和3个互补决定区（complementarity determining region，CDR）交替排布连接而成。抗体V区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性（周光炎，2007）。将人源单链抗体的CDR移植至其他动物来源抗体可变区，替代其他动物来源抗体CDR，使其他动物来源抗体获得人源单链抗体的抗原结合特异性，扩展杀虫蛋白基因资源的来源谱系，类似的这种技术手段在医学研究上已见报道（Jones, et al., 1986；Irie et al., 1989；Sompuram et al., 1996；Wu et al., 1999；Hamann et al., 2002），这种改型抗体（reshaped antibody），也称CDR植入抗体（CDR grafting antibody），比嵌合抗体（chimeric antibody）更进了一步。