[发明专利]一种荧光定量PCR鉴定菊花内、外源基因拷贝数的引物对及方法

权利要求书

1.PGK基因在荧光定量PCR鉴定菊花内、外源基因拷贝数中的应用，其特征在于PGK基因作为单拷贝的内参基因；所述的PGK基因在genbank中的登录号为KJ524576。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的菊花包括转基因菊花与非转基因菊花。

3.一种基于荧光定量PCR鉴定非转基因菊花内源基因拷贝数的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）提取菊花DNA；

（2）测定试样DNA质量和浓度，统一稀释成同一浓度50ng/ul，根据待测菊花内源基因的DNA片段设计并合成引物，引物设计参数为引物长度18-25bp，Tm 55-65℃，其中前后引物Tm值相差4℃，产物大小为100-300bp；

（3）在Mastercycler ep Realplex型号荧光定量仪上进行荧光定量PCR反应，每份样品进行内参基因PGK和待测内源基因的PCR反应，其中内参基因PGK荧光定量PCR反应使用SEQID NO.1/ SEQ ID NO.2所示的引物对，所述的PGK基因在genbank中的登录号为KJ524576；

（4）溶解曲线分析确定其唯一性，溶解曲线分析可以看出基因溶解曲线是否是单峰型，若为单峰，则说明在PCR扩增过程中没有出现非特异性扩增，由此推断定量PCR扩增所获得的数据是可靠的；

（5）分析荧光定量数据，确定基因拷贝数：根据待测菊花内源基因和内参基因PGK的CT值比较分析， PGK为单拷贝基因，待测基因每比PGK少一个CT值，则代表待测基因拷贝数为PGK拷贝数的2倍，若待测基因的CT平均值比PGK少n个，则可以确定菊花待测内源基因的拷贝数为2ⁿ;

其中, 每试样平行3 个，PCR检测重复3次，CT值取三次测定的平均值。