[发明专利]四纹豆象的分子标记序列及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于农作物病害防治领域，具体涉及一种四纹豆象的分子标记序列及检测方法。

背景技术

食用豆是人类重要的食物资源，是中国种植业结构调整、出口创汇和山区农民脱贫致富的重要作物。

四纹豆象(Callosobruchus maculatus Fabricius)，属鞘翅目(Coleoptera)，豆象科(Bruchidae)，瘤背豆象属(Callosobruchus)主要通过被害种子的调运、藏匿于包装物和交通工具的缝隙处进行远距离传播，通过成虫飞翔、搬运货物或工具作近距离扩散，在贮藏室内1个月可产生1个世代，可造成60％以上的重量损失，由此可见，四纹豆象一旦在我国广泛传播，必将对我国食用豆产业造成巨大损失。因此，2006年，四纹豆象被列入我国农业部公布的《全国农业植物检疫性有害生物名单》，2007年被列入农业部与国家质量监督检验检疫总局共同制定《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。因此对四纹豆象的快速、准确检测对防治四纹豆象虫害具有重要意义。此外，与四纹豆象同属瘤背豆象属的近似种绿豆象是世界性害虫，我国除西藏尚未发现外，其他各地均有发生危害。由于四纹豆象与绿豆象外形极为相似，尤其是与明色型的绿豆象，形态特征更为相近，因此，从外观上很容易将2种豆象混淆，从而可能在国内外食用豆种子的交流或贸易中造成四纹豆象的传播与扩散，对我国食用豆的安全生产和储藏造成严重威胁。

由此可见，获得能够准确、快速的将四纹豆象与其他豆象科害虫(特别是绿豆象)进行区分的四纹豆象特异性分子标记，在口岸检疫、 国内外引种交流和贸易中具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种将四纹豆象与其他豆象科害虫进行区分的四纹豆象特异性分子标记及方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种四纹豆象的分子标记序列，所述分子标记序列含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或者含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中的特异性序列。

可选的，所述分子标记序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种四纹豆象检测方法，其中，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在本发明所述的分子标记序列。

所述检测方法可以为PCR方法或者分子杂交方法。

可选的，所述方法包括以下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物；

2)检测扩增产物中是否存在本发明所述的分子标记序列。

当所述扩增产物中存在所述四纹豆象分子标记序列时判定待测样品中含有四纹豆象DNA。

当所述扩增产物中不存在所述四纹豆象分子标记序列时判定待测样品中不含有四纹豆象DNA。

本发明还提供了一种所述分子标记序列的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：

正向引物：5’-TTACATCACCAGGCAGTCCA-3’；

反向引物：5’-ACCGGTATTCAAACGGATTC-3’。

本发明还提供了所述分子标记序列或所述特异性引物在鉴别四纹豆象中的应用。

可选的，所述应用包括对待测样品进行PCR扩增反应，其中，所述PCR扩增反应在10μL体系中进行：10mmol L^-1Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，50μM dNTPs，0.2μM正、反向引物，0.5U Taq polymerase和20ng DNA模板。

扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；72℃ 10min。

可选的，所述应用包括将四纹豆象与绿豆象、菜豆象和豌豆象中的至少一种进行鉴别区分。

可选的，所述应用为鉴别区分四纹豆象与绿豆象，从而将这两种种属相同，形态学特征相近的豆象科害虫进行快速准确的区分。

本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明所述的特异性引物。

可选的，所述试剂盒中还含有阳性标准品，所述阳性标准品可以为含有本发明所述的分子标记序列的质粒DNA。

可选的，本发明所述的试剂盒中还含有PCR试剂。