[发明专利]一种增强桑树抗病能力的miRNA的克隆及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种增强桑树抗病能力的miRNA的克隆及其应用，该miRNA命名为mul‑miRn2，其具有序列表中SEQ.ID.NO.1所示的RNA序列，其前体RNA和编码基因序列分别具有序列表中SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列。在桑树中过表达SEQ.ID.NO.1所示的miRNA，可培育出对桑黄化型萎缩病和桑疫病具有较高抗性的转基因桑树；本发明的mul‑miRn2为培育抗病桑树新品种提供了新的基因资源，该基因可用于桑树或其他植物抗病性育种研究。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种增强桑树抗病能力的miRNA的克隆及其应用。

背景技术

桑树在我国已有数千年栽培历史，桑树作为家蚕的饲料树种，是蚕丝产业的重要物质基础。桑树除可供采叶养蚕外，桑叶、桑椹、桑枝、桑皮、桑根还具有很高的食用、药用和饲用价值。另外，桑树作为生态树种在防沙治沙、石漠化治理、水土保持、盐碱地治理、退耕还林等方面也发挥了重要作用，其经济和生态价值越来越受到重视。蚕业生产中为了养蚕需要对桑树进行剪伐采叶，持续的剪伐采叶易造成树势衰败，增加受到病虫害侵染的风险。我国已发现的桑树病害有100余种，能为害成灾的约40种。其中桑树黄化型萎缩病和桑疫病一直是危害桑树的重要病害，在我国各蚕区都有发生，往往造成桑叶产量和质量的降低，对蚕桑产业的发展产生不利影响，同时也限制了桑树药用、饲用和生态价值的实现。由于桑蚕对农药敏感，常规的农药难以在桑园施用，因此，培育广谱抗病新品种是解决这一问题的根本途径之一。

为了减少由环境胁迫造成的伤害，植物在进化过程中发展了复杂的响应机制，可以在转录、转录后和翻译后水平上调控基因的表达，增强自身抗性。miRNAs在植物体内作为基因表达的重要调控因子，能在转录和转录后水平上调节基因表达，其功能几乎涉及到生长发育、信号转导以及环境响应等生命进程的各个方面。病原菌在侵染植物的过程中会诱导宿主产生大量小分子RNA，其中一部分被证实为miRNA，植物也可以通过miRNA调控某些抗病途径中的关键基因来抵御病菌的入侵，在植物基础防御及生物胁迫响应中具有重要的作用。miR393是第一个被报道在植物病原相关分子模式触发免疫过程中具有作用的miRNA，该miRNA可以通过抑制生长素信号通路来提高植株对外源细菌侵染的抵抗能力。尽管目前国内外已从多种植物中克隆获得多个miRNA基因应用于分子育种并有多项研究成果申请了专利，但与植物抗病性相关的miRNA的专利仅见有陈浩等发明的“叶片特异性表达人工microRNA提高水稻对白叶枯病抗性的方法”(中国专利CN 101565701 A)，公开了一条21nt的人工设计的microRNA序列，并表明该miRNA在水稻叶片中特异性地表达可以增强转基因水稻对白叶枯病的抗性。方荣祥等发明的“培育抗病水稻的方法及其专用载体和启动子”(中国专利CN103194484A)，公开了一种培育抗病水稻的方法及其专用载体和启动子，将miR393的编码基因及驱动其表达的诱导型启动子导入目的植物，获得对水稻白叶枯病具有较高抗性的转基因植物。孙传宝和何玉科发明的“抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途”(中国专利CN102559666A)，公开了根据侵染植物的病毒中基因沉默抑制子的核酸序列设计出了沉默效果优异的寡核苷酸，这些寡核苷酸导入到植物体内后，在病毒侵染植物时能够在植物体内形成miRNA，与病毒基因沉默抑制子的mRNA结合，影响mRNA的转录，从而达到抑制病毒的效果。王兴军等发明的“利用人工microRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA”(中国专利CN102676510A)，公开了一种利用人工miRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA。但关于miRNA在桑树抗病育种中的作用，目前还未见报道。

发明内容