[发明专利]一种利用油菜CMS系根组织提取线粒体DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取油菜mtDNA的新方法，具体涉及一种利用油菜CMS系根组织提取线粒体DNA(mtDNA)的方法。

背景技术

细胞质雄性不育(CMS)是植物界普遍存在的现象。近年来，CMS作为作物杂种优势利用的重要途径，已受到国内外育种者们的广泛关注。一般研究认为，植物CMS的发生与线粒体密切相关，控制CMS的基因存在于线粒体DNA(mtDNA)上，而且mtDNA上控制CMS的基因有多个。进一步研究表明，mtDNA的基因突变或基因重组与CMS有直接关系，是形成CMS的主要原因。

在油菜育种实践中，CMS是油菜杂种优势利用最重要的途径，是提高油菜产量的主要手段。迄今为止，越来越多的证据已经表明mtDNA及其表达产物与油菜CMS直接相关(袁美等，2002)。由此可见，要从分子水平深入研究油菜CMS的不育机理，就必然涉及mtDNA的提取问题。另外，采用分子生物学方法鉴定油菜CMS的异同性也同样会涉及到mtDNA的提取问题。因此，mtDNA的提取是进行CMS分子机理研究的前提和基础，高效可靠的提取方法是提取mtDNA的重要保证。

目前，在油菜CMS的研究中，传统方法提取mtDNA所用的材料一般来源于绿色叶片或者黄化苗。然而，利用油菜的黄化苗或者绿色叶片提取mtDNA还存在一定的不足之处。一方面，在利用黄化苗mtDNA提取法提取油菜mtDNA时：(1)种子发芽缓慢，要培养获得无菌的黄化苗比较费工费时；(2)黄化苗长势弱小、细胞水分含量高、干物质积累少，故要获得足够量的mtDNA就需要耗费大量的不育系种子，也要消耗较多的人力和物力，而且在收获不育系种子时也容易造成混杂现象，以致影响到后续mtDNA提取的质量和纯度；(3)黄化苗也极易见光而出现返绿现象。另一方面，在采用叶片mtDNA提取法提取油菜mtDNA时：(1)绿色叶片组织中一般含有大量的叶绿体、多糖、酚类等成分，分离提取mtDNA时极易发生这些杂质成分的污染，特别是来自叶绿体DNA(cpDNA)的污染，会直接影响mtDNA提取的质量，所提取的mtDNA的得率和纯度常常达不到实验的要求；(2)为了获得较高质量和纯度的mtDNA，还需要通过采用超高速离心机结合密度梯度离心等繁琐步骤来减少叶绿体及其cpDNA等杂质成分的干扰，使提取过程复杂化，而且采用超高速离心机也使提取成本增加。

综上，探索一种有效解决黄化苗mtDNA提取法和叶片mtDNA提取法的不足之处，降低实验成本，提取的mtDNA得率高、纯度高，能够较好地满足后续分子生物学研究需要的提取mtDNA的方法，对深入研究油菜CMS系的分子机理以及培育高产或超高产杂交油菜新品种具有重要的意义。而关于采用油菜根部组织提取mtDNA的方法，国内外至今未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用油菜CMS系根组织提取mtDNA的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种利用油菜CMS系根组织提取mtDNA的方法，包括以下步骤：

(1)油菜根部组织的前处理和预处理：以油菜CMS系的幼嫩根部组织为材料，先清除根部表面附着的土壤颗粒和杂质，用自来水冲洗干净根部，再用蒸馏水漂洗1～3次，然后室温下，将根部进行黑暗预处理48～72h；

(2)油菜根部组织的匀浆和过滤：将处理后的幼根剪成1～2cm的小段，放入预冷的匀浆杯中，然后加入5mL/gFW预冷的提取缓冲液A，匀浆至根细碎；接着将匀浆液用2～4层灭菌纱布过滤，再用1～3层180～230目滤网过滤；

(3)油菜根部组织线粒体的提取与纯化：先采用差速离心法粗提线粒体，然后采用蔗糖衬垫法纯化线粒体，最后采用裂解法精提取线粒体DNA。

进一步，步骤(1)中，所述油菜CMS系幼嫩根部组织材料选自田间油菜CMS系的苗期至蕾苔期的新鲜幼嫩的根部组织。

进一步，步骤(2)中，所述缓冲液A是由Tris-HCl10mmol/L，蔗糖500mmol/L，EDTA2mmol/L，BSA0.2％，β-巯基乙醇0.1％；调pH至7.5制成。

进一步，步骤(3)中，所述差速离心法粗提线粒体是指将经过匀浆和过滤得到的滤液先在1000×g离心10min，取上清液；再以17000×g离心10min，弃上清液；沉淀中加入缓冲液A并悬浮；再以1000×g离心10min，取上清液，得到线粒体粗提液；