[发明专利]结核分枝杆菌Rv2991重组蛋白、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药体外诊断试剂技术领域，特别涉及结核分枝杆菌Rv2991重组蛋白、制备方法及其应用。

背景技术

结核病由病原体——结核分枝杆菌感染机体所致，至今仍为人类重要的传染病。快速、准确的诊断结核分枝杆菌(MTB)感染，对于结核病的控制具有重要意义。MTB感染的诊断方法有很多，目前临床最为常用的方法仍然依靠传统的痰涂片细菌学检查，但检出率低；MTB培养可作为结核病确诊的“金标准”，但其培养时间太长，一般4-6周，难以满足临床需要；Bactec技术虽缩短了培养时间，但费用较高，短时间内难以推广普及；X线和CT检查仅提供影像学可能性诊断；聚合酶链反应(PCR)技术及其它基因诊断方法作为临床诊断尚存在操作复杂，对技术和人员专业素质要求较高，且仍不能用于菌阴结核病的快速诊断。抗结核免疫主要是细胞免疫，包括致敏的T淋巴细胞和被激活的巨噬细胞。致敏的T淋巴细胞可直接杀死带有结核杆菌的靶细胞，同时对释放多种作用于世噬细胞的淋巴因子，使巨噬细胞聚集在病灶周围形成以单核细胞为主的增生性炎症。被激活的巨噬细胞极大地增强对结核杆菌的吞噬消化，抑制繁殖，阻止扩散，甚至销毁的能力，充分发挥细胞免疫的作用。目前广泛应用的结核病细胞免疫诊断技术仍依赖于皮试检测试剂---结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)。然而PPD存在与环境分枝杆菌以及BCG疫苗株的交叉反应，所以诊断价值偏低。因而发现新的结核病细胞免疫标志物，并建立新的结核病细胞免疫诊断方法是结核病诊断所亟需的。

发明内容

为克服现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌Rv2991重组蛋白、制备方法及其应用。

本发明提供一种结核分枝杆菌Rv2991重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

本发明的结核分枝杆菌Rv2991重组蛋白是通过使用pET28a质粒，在Rv2991该天然蛋白序列前面加了一段His·Tag纯化标签获得的；所述His·Tag纯化标签的氨基酸序列由SEQIDNO:1中从氨基末端第1至第17位氨基酸残基序列组成。SEQIDNO:1中从氨基末端第18至第180位氨基酸残基序列组成天然Rv2991蛋白氨基酸序列。

本发明还提供一种编码上述结核分枝杆菌Rv2991重组蛋白的基因，其具有如下所示的核苷酸序列：

①如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；

②不同于SEQIDNO:2但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

③在严格杂交条件下与上述①或②中的序列杂交，并且编码具有所述结核分枝杆菌Rv2991重组蛋白活性的核苷酸序列。

本发明的一个方面，提供了一种包含所述结核分枝杆菌Rv2991基因的重组质粒，即将Rv2991基因序列插入商用表达质粒序列中。Rv2991基因NCBI登陆号为:NC_000962.3；蛋白号为：NP_217507.1。

本发明的“Rv2991基因序列”也包括对NC_000962.3中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与NC_000962.3核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码相同的氨基酸序列。该术语还包括在中度严密条件下，更佳地在高度严密条件下与NC_000962.3的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与NC_000962.3的核苷酸序列同源性至少70％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

本发明的重组质粒，通常将Rv2991基因插入表达质粒的多克隆位点处得到。

本发明的重组质粒在制备过程中，可选用本领域已知的各种载体，然后将编码本发明的核苷酸序列可操作性地连接于表达调控序列，从而形成蛋白表达载体。

本发明中可采用的载体有pET28a等。本发明的一个实施例中，所用的质粒为pET28a。

本发明还提供一种上述结核分枝杆菌Rv2991重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备结核分枝杆菌菌株基因组DNA；

(2)扩增结核分枝杆菌Rv2991基因；

(3)结核分枝杆菌Rv2991基因插入表达质粒；

(4)将构建的表达质粒转化入宿主细胞；

(5)诱导表达结核分枝杆菌Rv2991蛋白；

(6)分离纯化诱导表达产物，得到结核分枝杆菌Rv2991重组蛋白，