[发明专利]用于环状RNA表达的DNA序列和表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于环状RNA表达的DNA序列和相应的表达载体及其应用。

背景技术

环状RNA（ciucularRNA，circRNA）是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。

研究表明环状RNA主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定，难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好，表达具有组织及时空特异性等特征。已有研究显示环状RNA跟神经发育、动脉粥样硬化、强直性肌营养不良、癌症等疾病相关。此外，最新研究在在人唾液和血液中检测到环状RNA的存在，提示环状RNA可以在血液，尿液，腹水等临床标本中稳定存在，这些特点使得环状RNA在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。

但是目前对circRNA的功能及其调控机制知之甚少。研究发现，circRNA可以作为“sponge”海绵吸附miRNA，阻断miRNA对其靶基因的抑制作用；circRNA可以通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；此外，circRNA还可能具有与蛋白质结合，调控蛋白的活性等功能。

要研究circRNA的功能和调控机制一个必不可少的手段就是在细胞内过表达感兴趣的circRNA，观察其对细胞功能的影响。那么，要提高circRNA在细胞中的表达效率进而研究其功能和调控机制，需要高效、稳定的过表达基因研究的工具。

目前文献报道circRNA过表达一般采取常见的商业化过表达载体如pcDNA3.1等，但是按照常方法将circRNA序列插入到载体中表达出来的是相应的线性mRNA，无法有效表达出circRNA。需要采取特殊的策略，以基因组DNA为模板，扩增circRNA序列及其上游1000bp和下游200bp的序列，然后将上游800bp序列通过反向互补插入到下游，这样得到的序列才能表达circRNA。2014年Liang对一个表达丰度极高的circRNA（hsa_circ_0001727）的两侧内含子序列进行研究，并构建了一个circRNA表达载体，但是该载体有局限性，仅个别circRNA用该载体能表达成功，成功率低[20]。现有方法操作繁琐，实验难度大，实验周期长，成功率低，给广大学者研究circRNA带来了极大的不变，限制了circRNA分子作为新型标志物及疾病治疗靶标的研究和开发。

因此有必要从circRNA的形成机制及结构特点出发，开发出一种简单易行，稳定高效的circRNA过表达DNA模序及相应的载体。

circRNA是通过RNA可变剪接产生的。真核生物基因的剪接为GT-AG法则，即前体RNA中参与内含子剪接的两个特殊位点，即在内含子和外显子交界处有两个相当短的保守序列：5’端为GT，3’端为AG，成为GT-AG法则。典型的剪接位置一致顺序组成为：5'-AGˉGUAAGU--------------YNYURAY--Y10-20--YAGˉG-3'。其中Y为U或C，N为任何核苷酸，箭头所指为外显子与内含子的交界。5’端剪接位称供体位（donorsite），3’端剪接位称受体位（acceptorsite）。内含子中还有另一段识别剪接边界必不可少的序列称为分枝点，位于3‘-端剪接位的上游，具有特征性组成：-YNCURAY-，Y表示嘧啶（U或C），R表示嘌呤（A或G），A是剪接时参与形成分枝的特别位点。紧接在分枝点的下游有一段多嘧啶序列，也是参与剪接事件蛋白接合的位置。GT-AG保守剪接供体和受体的存在有利于提高可变剪接发生效率，大大提高RNA环化概率。

Jecketal等2013年在人Hs68细胞中发现了超过25000个环状RNA，经生物信息学分析发现，circRNA的一个显著特点是两侧的内含子序列较长，是常规基因的3倍以上，而这些长的内含子中富含反向重复序列，其中最典型的就是Alu重复序列。Alu重复序列是人类基因组中一族散布的、长度大约为300bp的中等重复序列(重复频率10～10⁴)。分析circRNA上下游500bp序列，发现20%的circRNA上下游包含Alu反向重复序列，含有ALU重复序列的circRNA表达水平是对照的6倍以上，因此反向重复序列有助于提高circRNA的表达水平。

文献报道的circRNA过表达方法需要扩增circRNA本身序列及其上下游序列，并将上游序列反向互补插入到下游，构建方法操作繁琐，实验难度大，实验周期长，给广大学者研究circRNA带来了极大的不变。