[发明专利]一种牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方法，其方法为：第一步、设计特异性的定量引物；第二步、乳腺组织RNA的提取；第三步、将乳腺组织RNA反转录为cDNA；第四步、进行荧光定量PCR反应。有益效果：提供了一种简单、快速、低成本、精确度高、便于在基因组水平上筛查和检测C4BPA基因与奶牛乳脂代谢的相关性的定量PCR方法。为进一步研究该基因及探讨可能影响奶牛乳脂的基因提供了依据及可靠的研究方法。本发明筛查获得C4BPA基因与奶牛乳脂代谢相关，可用于奶牛的育种工作，以便满足不同人群对牛奶中乳脂含量的要求。

技术领域

本发明涉及一种定量PCR检测方法，特别涉及一种牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方法。

背景技术

当前，荧光定量PCR技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验方法，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。荧光定量PCR所使用的荧光化学有两种，一种是荧光探针，如TaqMan荧光探针，在PCR扩增时加入一对引物同时也加入一个特异性的荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，当探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不发射荧光，但当PCR扩增时，Taq酶的外切酶活性将探针酶切使其降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团相互分离，从而荧光检测系统就可以接受到荧光信号，从而实现了对荧光信号的累积。另一种是SYBR荧光染料，将SYBR荧光染料非特异性的插入DNA双链后,发射出荧光信号，而不能插入的SYBR染料分子则不能发射荧光，这样保证荧光信号和PCR产物同步增加。

转录组测序是基因功能及结果研究的基础和出发点，通过高通量测序，能全面的获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的所有转录本序列信息，而C4BPA基因是通过对高乳脂奶牛及低乳脂奶牛的乳腺组织进行转录组测序选择出的差异基因。

C4(Complement 4)是补体系统中补体激活第一途径中的一个重要成分，1977年Ferreira等报道了小鼠血清中的一种蛋白质,其分子结构模式现多以Dahlback等描述的蜘蛛样结构来进行分析，能与补体C4成分特异性结合，同时也发现人中也有该种物质，而这种物质被称为C4结合蛋白。

C4BP(complement component 4binding protein)是参与控制补体活化的抑制因子，对维持补体在体内的平衡起重要的调节作用。C4BP也是作为I性因子的一种辅因子，促进I性因子对C4b的裂解，也有抑制C3转化酶的活性的作用。C4BP是由7条相同的α链和1条β链组成，并且C4b的结合位点是位于α链，而β链是蛋白质S的结合位点。2012年Hillarp A等发现兔子和牛的血清中缺乏C4BP蛋白质S的复合体，β链基因未表达,而鼠的β链基因也被进化成一种假基因。2014年Strickland DK等发现C4BP的α链上有结合LRP的结合位点。LRP能够与多种结构及功能各异的配体相互作用，不仅可以对血脂的动态平衡及纤溶系统功能的稳定进行调节的作用，而且能参与多种生长因子、细胞激酶、生物学效应的发挥。C4BP可以通过结合孔蛋白，可以稳定调节血清对淋球菌的抵抗性，人类的C4BP可以选择性的与淋病奈瑟氏菌相互作用，而造成物种间特异性的感染。2006年Jenkins HT等发现C4BP与淋病奈瑟氏球菌、百日咳博德特氏杆菌、化脓性链球菌、大肠杆菌的相互作用，是定位于C4BP的α链的不同区域，α链上有与其结合的相应位点，并使其表达出相应的性状。因此进一步研究C4BP的α链具有重要的意义，研究其他功能和作用也具有很大的价值。但目前对于C4BPA基因的研究还比较少，关于C4BPA基因与奶牛乳脂代谢相关性的研究尚未有报道。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方法。

本发明提供的牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方法，其方法如下所述：