[发明专利]一种超声波辅助外源基因转化酵母菌的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及外源基因导入微生物的方法，尤其涉及一种将构建的含有外源基因的质粒导入酵母菌的高效超声波转化方法。

(二)背景技术

胆固醇氧化酶在食品开发、医疗保健、临床检测、生物农药等方面具有广泛的应用价值。目前国内胆固醇氧化酶市场供应短缺，都从国外进口。随着研究深入，它的市场范围也从最初的临床诊断试剂扩展到食品加工、制药工业、生物化学和生物抗虫等领域，产品需求量越来越大。但是野生菌株达不到工业化生产要求，故目前都集中在通过基因工程方法来提高胆固醇氧化酶产量。而常规的基因工程方法要求有高端仪器设备，所用试剂昂贵且大多对人体和环境有害，超声波作为一种物理方法可以解决这种不利。

转化是指受体菌直接从周围环境中吸收供体菌游离的DNA片段，并整合入受体菌基因中，从而获得了供体菌部分遗传性状的过程。通常可经过物理或者化学的方法来提高转化率。传统的方法有化学促进法，载体介导法和机械法等，这些方法尽管得到广泛应用，也取得不菲的成果，但是都有不同程度的缺陷。有的效率低下，有的过程繁冗，有的成本昂贵，特别是一些细胞只对某一个或某几个方法敏感。而物理方法是基于细胞膜的破坏来提高通透性，不依赖于细胞型，因此更具有广泛应用价值。超声波是一种传统的细胞破壁技术，被认为是一种潜在的转化方法。

(三)发明内容

本发明提供一种超声波辅助外源基因转化酵母菌的方法，该方法新颖、转化条件温和、成本低、绿色环境，易于实现基因转化的方法，解决了现有方法转化率低，细胞活力低，易死亡等问题。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种超声波辅助外源基因转化酵母菌的方法，所述方法为：将携带外源基因的表达质粒与酵母菌感受态细胞悬液混合，加入二甲基亚砜构成反应液，调节反应液pH值至5.0～6.0，在28～32℃、超声波场强200～500W的条件下进行转化反应，转化反应结束后，筛选获得含外源基因的酵母菌的阳性转化子；所述酵母菌感受态细胞悬液是由酵母菌感受态细胞与冰预冷的1mol/L的山梨醇水溶液重悬而成。

进一步，所述二甲基亚砜在反应液中体积终浓度为1-4％。

进一步，所述转化反应在28～32℃、超声波场强200～500W的条件下反应10～30min。

进一步，所述携带外源基因的表达质粒中外源基因为胆固醇氧化酶基因，核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

进一步，所述酵母菌为毕赤酵母菌(Pichiapastoris)GS115，购自invitrogen公司。

进一步，所述携带外源基因的表达质粒与酵母菌感受态细胞悬液体积比为1:40-55，所述酵母菌感受态细胞悬液中湿菌体含量为1×10⁷～1×10⁸个细胞/ml。

进一步，所述酵母菌感受态细胞按如下步骤制备：将酵母菌接种至YPD液体培养基中，28～30℃振荡培养过夜，取培养液以体积浓度10％的接种量接种到YPD液体培养基中，28～30℃培养至OD₆₀₀＝1.3～1.5，在4℃、1500r/min条件下离心5-10min，收集湿菌体；将湿菌体置于冰水预冷的装有无菌水的无菌聚丙烯管中，于4℃，1200r/min离心5min，弃上清，重复操作2次(即加入无菌水重悬沉淀并离心，后一次无菌水体积用量为上一次的50％)，再用冰预冷的1mol/L的山梨醇水溶液将菌体沉淀重悬，4℃，1200r/min离心5min，弃上清，用冰预冷的1mol/L的山梨醇水溶液将菌体沉淀重悬，获得酵母菌感受态细胞悬液。

进一步，所述携带胆固醇氧化酶基因的表达质粒为pPICZB-choB载体质粒。

本发明所述超声波辅助外源基因转化酵母菌的方法，具体按如下步骤进行：

(1)酵母菌感受态细胞的培养和收集