[发明专利]一种肝癌干细胞的无血清培养基及其培养方法

权利要求书

1.一种肝癌干细胞的无血清培养基，其特征在于，以DMEM／F12+GlutaMAXTM^-1培养基为基础，包括：人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10、胰岛素一号增长因子、无血清补充营养成分、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液。

2.如权利要求1所述的肝癌干细胞的无血清培养基，其特征在于，相对于DMEM／F12+GlutaMAXTM^-1基础培养基，人重组表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10的浓度为10-30ng/ml、胰岛素一号增长因子的浓度为10-30ng/ml、无血清补充营养成分的浓度为1-3%、肝素的浓度为40-60mg/ml、青霉素+链霉素双抗溶液的浓度90-110U/ml。

3.一种如权利要求1肝癌干细胞的无血清培养基的培养方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

步骤A:培养基制备：在无菌超净工作台中将重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10、胰岛素一号增长因子，无血清补充营养成分、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液添加至DMEM／F12+GlutaMAXTM^-1培养基中，吹打混匀；

步骤B:复苏人肝癌细胞系：将细胞从液氮罐中取出后，水浴箱振荡使其充分均匀受热后快速融化；

在超净工作台中，加入10%FBS高糖DMEM完全培养基,离心弃掉上清;再用10%FBS高糖DMEM完全培养基重悬细胞，吹打混匀，于透气培养瓶中培养；

步骤C:肝癌细胞用含质量浓度10%FBS的DMEM高糖培养基进行培养，贴壁长至80%-90%时传代；吸去培养瓶中的培养基，培养瓶中加入PBS清洗后，加入0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液，倒置显微镜下观察，见贴壁细胞开始变圆、漂浮脱落即加入含有10%FBS的高糖DMEM的完全培养基终止消化，离心弃上清；PBS洗涤细胞后再离心；

步骤D:加入含添加生长因子的DMEM／F12+GlutaMAXTM^-1培养基，吹打混匀，转入新培养瓶培养；

步骤E:当细胞球布满的密度为80%-90%时，吸取全部培养基和细胞离心，弃上清，PBS重悬后离心，加入0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液消化，吹打成单细胞，终止消化，离心，加入含生长因子的DMEM／F12+GlutaMAXTM^-1培养基传代，重复前述操作进行传代培养。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤B和步骤D中，所需的培养环境：温度为37℃、CO₂体积浓度为5%。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤E中，DMEM／F12+GlutaMAXTM^-1培养基按1:2或者1:3传代。

6.如权利要1所述的肝癌干细胞无血清培养基在人肝癌细胞系MHCC-97H和MHCC-97L培养中的应用。