[发明专利]一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物显微形态学领域，特别是一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法。

背景技术

单宁即鞣质，指分子量为500-3000的能沉淀蛋白质、生物碱的水溶性多酚化合物。单宁广泛存在于中草药和植物食品，由于具有独特的功能活性，目前植物多酚已广泛应用于医药、食品、制革和日用化工等相关领域，并发挥着不可替代的作用。医药上单宁可止血愈伤，抑菌抗过敏，尤其是具有抗氧化、抗癌变、防止心脑血管疾病的功效，成为近年酚类物质的研究热点。在亚显微结构水平上观察单宁的产生、运输、储存和分布需要做超薄切片。超薄切片要经过染色才能在电镜下显示清晰的结构，铅和铀盐都是优良染色剂，但染色特征又有不同，所以经常采用“双染色法”，即先用铀染，后用铅染，铀、铅双染色已成为超薄切片常规染色方法（见“植物显微技术”，科学出版社2010年6月第二版72页倒数第3、4行），自20世纪60年代以来，通常采用醋酸铀-柠檬酸铅双染法进行电子染色，以提高细胞结构成分的反差，增强图象的清晰度，使各种组织成分达到满意的染色效果（见《组织化学与细胞化学技术》，人民卫生出版社2014年12月第2版第79页，以及“醋酸双氧铀-柠檬酸铅染液复染方法的具体步骤及染色液配制”，2008年7月7日百度知道）。然而，醋酸铀（又称乙酸铀）和柠檬酸铅不仅价格昂贵，醋酸铀本身具有放射性，光照和高温下不稳定（详见百度百科醋酸铀即乙酸铀危险品运输编号2917和《安徽农业科学》2013年第13期），因此使用时应注意避光，铀也是一种核燃料，醋酸铀的使用在许多国家受到限制。柠檬酸铅毒性大（见中国化工制造网2013年1月11日柠檬酸铅资料），染色时需注意密封以减少污染，特别是铅染液很容易与空气中CO₂分子反应生成碳酸铅沉淀物，造成切片的污染，而且不安全。因此发明一种简便、低廉、安全的用于观察植物中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法，是亟待解决的技术问题。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法，可有效解决简便、低廉、安全的用于观察植物中单宁类物质分布结构的问题。

本发明解决的技术方案是，将植物材料在含有咖啡碱和戊二醛的浸渍液中浸渍，再用锇酸固定，乙醇脱水，Epon 812包埋，超薄切片，用绿茶提取液染色，具体步骤是：

（1）、切块：在室温下，将植物切成1mm³的小块，0~4℃保存；

（2）、浸渍和固定：首先配制浸渍液，浸渍液是由pH7.0的磷酸缓冲液、戊二醛、咖啡碱混匀制成，重量百分比为戊二醛3%~9%、咖啡碱0.5-2.5%和余量为pH7.0的磷酸缓冲液（总量100%），切块置入浸渍液中浸渍2—16h，开始时，每0.5-1h更换一次浸渍液，连续更换3次，得浸渍后的切块；浸渍后的切块再置入质量浓度1%~2%的锇酸（OsO₄）固定液固定1~2h；

（3）、漂洗：从锇酸固定液中取出切块，用蒸馏水漂洗5min，去除切块表面的锇酸；

（4）、脱水：在室温下，依次用体积浓度30%乙醇溶液、体积浓度50%乙醇溶液、体积浓度70%乙醇溶液、体积浓度90%乙醇溶液各脱水10~20min，将切块捞出，再用100%乙醇溶液中脱水2-3次，每次10-20min；

（5）、渗透：采用梯度对Epon 812渗透，方法是，首先按重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰3混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为3︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812，35~40℃下静置12h；

（6）、包埋和聚合：将切块包入胶囊或包埋板中，加入渗透后的Epon 812，放烘箱中加热，35℃加热12h ，45℃加热12h ，60℃加热24h，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；

（7）、修块：将包埋块经粗修，修整成梯形；

（8）、切片：将梯形包埋块切成厚度60~80μm的切片，制干；

（9）、染色：将切片相间隔放在蜡盘上，用吸管吸取体积浓度0.2-0.5%的绿茶提取液，逐滴滴在切片上，盖好蜡盘染色10-30分钟；

所述的蜡盘是由培养皿中浇铸融化的石蜡，冷却后制成；