[发明专利]稻飞虱翅中总RNA高效提取的方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种稻飞虱翅中总RNA高效提取的方法。

背景技术

褐飞虱(Nilaparvatalugens)、灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)和白背飞虱(Sogatellafurcifera)同属于半翅目(Hemiptera)、飞虱科(Delphacidae)，是目前亚洲水稻上的重要害虫。它的危害不仅能以成虫和若虫群集刺吸水稻韧皮部筛管汁液，影响水稻生长发育，同时也是多种病毒病害传播的媒介昆虫。水稻南方黑条矮缩发病轻重就与带毒白背飞虱的迁入量有关。稻飞虱成虫个体可分为长翅型与短翅型，其它昆虫种类翅的分化现象也很普遍。现有的研究表明，昆虫翅型的分化受多种因子的影响。目前已确定外界环境条件与遗传因子共同决定了昆虫的翅型。因此飞虱翅中与翅型相对表达量有差异的相关基因对研究飞虱翅型分化具有重要的意义。

欲对RNA进行研究，首先要从组织中提取得到高质量的RNA。但RNA与DNA不同，极容易发生降解，RNA降解将对后续研究的真实性及可靠性产生极大的影像。引起RNA降解的主要因素是RNA酶。RNA酶有2种来源，一种是外源性的，一种是内源性的。因此在采集用于RNA提取的样品时，重点就在于如何防止外源性RNA酶污染及抑制内源性RNA酶活性上。外源性RNA酶可以通过DEPC等RNA酶抑制剂处理实验用品以及严格的实验操作和试验环境的控制来加以排除。而内源性RNA酶却很难去除，只能通过液氮或干冰制造低温或者组织样品保护液浸泡的方法来进行抑制。但对于某些组织来说，这样的处理很难达到预期效果，比如飞虱翅翼组织。

由于飞虱翅质地透明、纤薄，使用传统液氮冻存后不方便研磨，且翅翼角质化程度高，使用样品提取液无法快速渗透到组织内部，起不到抑制RNA酶的效果。这些都是影响翅总RNA提取量及质量的重要因素，这些问题都阻碍了对翅中基因RNA水平表达研究的进展。本发明就是为了解决以上难题而提供了一种从样品收集开始，包括样品分离、液渗透浸入，到总RNA的高效提取的方法。

目前尚未见有飞虱翅中总RNA高效提取的报道。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不能有效高效提取稻飞虱翅中总RNA的问题，本发明提出了一种能够获得高质量RNA，且不被外源或内源RNA酶降解到最低限度，能最大限度地保持被提取的总RNA的纯度，以利于后续试验的利用的稻飞虱翅中总RNA高效提取的方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：稻飞虱翅中总RNA高效提取的方法，包括以下步骤：

a)实验用具及耗材灭菌及RNA酶灭活处理：用0.1％DEPC水溶液浸泡实验器材和枪头24h以上，部分耗材利用灭菌锅高温高压湿热灭菌处理，玻璃棒及石英砂等利用干燥箱200℃干热灭菌处理2h以上；工作台面用RNA酶清除剂擦拭干净；解剖针置于无水乙醇中浸泡后用酒精灯进行灼烧灭活处理；

b)稻飞虱翅的分离：将稻飞虱成虫利用无RNA酶水漂洗数次后，放入离心管中迅速置于液氮罐中数十秒，使其迅速死亡，用灭菌后的解剖针迅速解离出稻飞虱翅部，避免残留翅根部肌肉组织带入，装入已加入300μLTrizol试剂的离心管中，并放置在冰上，收集到长翅60头以上，短翅120头以上的稻飞虱翅翼后，将离心管置于-40℃保存24h；

c)总RNA的提取：

c1)在室温下解冻步骤b得到的样品，待样品处于熔融状态时利用高温灭菌后的玻璃棒沿着管壁研磨翅翼，待研磨难以进行时加入200目规格0.01g石英砂助研磨，使翅脉中内容物充分释放，研磨完毕再加入700μLTrizol试剂，混匀静置2min；

c2)加入200μL氯仿，剧烈振荡后室温静置；

c3)将上述混合物离心后获得水相、蛋白相和氯仿相，取水相，加入与水相等体积的异丙醇溶液，轻轻颠倒混匀后室温下静置10min；

c4)将步骤c3)中得到的混合物继续离心后弃掉液体，保留管底微量白色固体；

c5)配制75％乙醇溶液：吸取无水乙醇750μL于一个新的无RNA酶离心管中，再加入0.1％DEPC处理水250μL，颠倒摇匀，放置冰上冷却；

c6)将1mL75％乙醇溶液加入步骤c4)得到的含有沉淀物的离心管中，剧烈振荡，使白色沉淀物悬浮在乙醇溶液中；

c7)重复以上步骤c4)-c6)，再进行两次洗涤；