[发明专利]双脂肪酶细胞表面共展示工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种双脂肪酶细胞表面共展示工程菌，其特征在于：为以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p作为锚定蛋白，以米根霉脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶B为双脂肪酶靶蛋白，共同展示在毕赤酵母细胞表面，构建出的双脂肪酶细胞表面共展示重组酵母工程菌。

2.权利要求1所述的双脂肪酶细胞表面共展示工程菌的构建方法，其特征在于，以Sed1p为锚定蛋白，使其与米根霉脂肪酶N端连接，通过该锚定蛋白的N端重复序列，以共价键方式，将米根霉脂肪酶ROL固定于毕赤酵母细胞表面，实现诱导表达，得到单独展示米根霉脂肪酶的重组酵母；再将该单独展示米根霉脂肪酶的重组酵母制备成感受态细胞，将构建的南极假丝酵母脂肪酶B表达质粒pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p电转化至单独展示ROL的重组酵母感受态细胞中，筛选得到表面共展示ROL和CALB的重组酵母阳性转化子。

3.根据权利要求2所述的双脂肪酶细胞表面共展示工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将靶蛋白米根霉脂肪酶ROL的基因序列克隆到表达载体中，得到表面展示重组质粒载体；再将锚定蛋白基因Sed1p克隆到表面展示重组质粒载体中，使酿酒酵母细胞壁蛋白基因与靶蛋白米根霉脂肪酶基因形成融合基因，得到以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p为锚定蛋白的米根霉脂肪酶细胞表面展示表达质粒；

（2）将米根霉脂肪酶细胞表面展示表达质粒电转化至巴斯德毕赤酵母，根据表达载体上的筛选标记筛选得到单独展示米根霉脂肪酶的重组毕赤酵母阳性转化子；

（3）将单独展示米根霉脂肪酶ROL的重组酵母制备成感受态细胞；

（4）采用与步骤（1）相同的方法构建南极假丝酵母脂肪酶B的细胞表面展示表达质粒pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p，将pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p电转化至单独展示米根霉脂肪酶的重组酵母感受态细胞中，通过阳性转化子筛选得到米根霉脂肪酶ROL与南极假丝酵母脂肪酶B细胞表面共展示的重组酵母细胞。

4.权利要求1所述的双脂肪酶细胞表面共展示工程菌做为双脂肪酶细胞表面共展示型全细胞催化剂在催化油脂转酯化制备生物柴油中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，催化转酯化制备生物柴油的油脂原料为大豆油、菜籽油、小桐子油或麻风树籽油、橡胶籽油，微藻油脂，餐饮废弃油脂。