[发明专利]杂交瘤细胞株及其产生单克隆抗体和它们在检测G2-EPSPS蛋白中的应用

说明书

本发明提供了一对杂交瘤细胞株。该对杂交瘤细胞株包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10495；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10494。本发明还提供了由这两株杂交瘤细胞分泌的一对配对单克隆抗体和它们在检测G2‑EPSPS蛋白中的用途以及一种免疫胶体金试纸。通过上述技术方案，本发明能够通过免疫胶体金试纸，对G2‑EPSPS蛋白的检测取得1ng/mL的灵敏度，对CP4‑EPSPS蛋白不呈现交叉反应，并且对27种非转基因作物和14种不同来源的各种非G2‑EPSPS转基因作物也不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种杂交瘤细胞对、一种单克隆抗体对和它们在检测G2-EPSPS蛋白中的用途以及一种免疫胶体金试纸。

背景技术

草甘膦是美国孟山都公司研发并于1974年注册的一个新型除草剂，注册的商品名为草甘膦的理化性质稳定，合成成本低，高效、广谱、低毒、低残留，是一型十分优秀的除草剂，也是世界上使用最广泛的除草剂品种之一。研究发现，草甘膦通过竞争性结合EPSPS(5’-烯醇式丙酮芒草酰-3-磷酸合酶)从而阻断莽草酸代谢途径，造成植物无法合成芳香族氨基酸及其衍生物，以及莽草酸积累，导致植物死亡。由于自然界中绝大部分植物体内EPSP合酶均属于草甘膦敏感型，因此草甘膦除草剂具有十分优秀的广谱性。但是自然界微生物群体的多样性造就微生物中EPSP合酶的多样性，部分微生物体内EPSP合酶对草甘膦不敏感，利用基因工程技术将草甘膦不敏感EPSP合酶转入目标植物中以替代内源敏感型EPSP合酶，将使该植物获得草甘膦除草剂抗性。美国孟山都公司利用这一策略于1989年从根癌农杆菌CP4中克隆到了高抗草甘膦的EPSP合酶，并将该基因转入大豆品种中，于1991年获得抗草甘膦转基因大豆品种Roundup Ready，并1996年正式进入商品化生产。

抗草甘膦除草剂转基因大豆是世界上第一例商业化种植的转基因作物，随后孟山都公司利用该基因先后研发了多种转基因抗草甘膦作物(大豆、棉花、玉米、苜蓿、甘蔗等)。自1996年上市以来，在全世界转基因作物品种及种植面积迅猛增加，从171万公顷增加到2014年的1.815亿公顷。全球种植转CP4-EPSPS作物累计超过1亿公顷。

G2-EPSPS蛋白编码基因克隆自草甘膦污染土壤细菌基因组文库，具有很高的草甘膦耐受性。该基因编码的蛋白经分析属于Class I类型，酶活测定显示该蛋白具有高底物亲和能力和低草甘膦亲和力，因此能赋予宿主高草甘膦除草剂耐受力。在酶学水平上G2-EPSPS基因草甘膦耐受性高于孟山都公司的CP4-EPSPS基因。

在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。现有的检测装置，如采用酶免、放免等方法的装置，受仪器(酶标仪、放免闪烁仪、离心机等)、场地等因素的限制，而且检测时间长(酶免检测时间需2h、放免检测需3h左右)，检测成本较高，很难推广应用。因此，实践中需要有一种可快速检测转基因植物中G2-EPSPS蛋白，且操作简便、结果准确可靠、快速的装置。

免疫结合胶体金层析法是免疫金标记技术和抗原抗体反应相结合而形成的一种应用形式，相比ELISA，除标记物不同外，同样服从于抗原抗体反应的特性。免疫结合胶体金层析法以微孔膜为固相载体，包括双抗体夹心法、双抗原夹心法、捕获法和竟争抑制法等实施方法，其中，以双抗体夹心法应用最为广泛。