[发明专利]基于扫描振镜的单点去卷积显微系统与成像方法

说明书

技术领域

本发明基于扫描振镜的单点去卷积显微系统与成像方法属于光学显微测量领域。

背景技术

在纳米技术和生物技术的研究当中，高分辨显微成像技术起到了至关重要的作用。特别是在生命科学领域，为了更好地理解人体生命的作用过程和疾病的产生机理，需要观察细胞(细胞内器官)、病毒等在三维细胞内的三维空间位置和分布，需要在细胞内精确定位特定的蛋白质以研究其位置与功能的关系。而反映这些体系性质的特征尺度都在纳米量级。光学显微技术可以通过非接触的方式实现快速成像、长时间监控成像，同时不会影响生物体系的活性。近年来，随着新的荧光探针和成像理论的出现，光学显微镜的分辨率得以突破光学衍射极限，达到可以与电子显微镜相媲美的精度，并可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质。这些分辨率突破光学衍射极限的显微技术被称为超分辨显微术。其中，最著名的当属获得2014年诺贝尔奖的受激辐射损耗(Stimulated Emission Depletion，STED)显微技术。

STED技术由Stefan W.Hell提出(Hell,S.W.and Wichmann,J.(1994),‘Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission:Stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy’，Optics Letters，19(11):780–782)，其基本思想是同时照射两束具有不同波长的皮秒脉冲激光光束，其中一束皮秒脉冲激光光束在样品表面会聚成面包圈状的第一聚焦光斑，另外一束皮秒脉冲激光光束在样品表面会聚成第二聚焦光斑，将两个光斑中心重合，其中位于光斑中心区域的荧光物质激发出荧光，位于光斑内但不在光斑中心区域中的荧光物质发生退激发，不发出荧光，从而实现超分辨成像。

发明内容

本发明在传统STED技术的基础上，在不同时刻照射两束具有相同波长的激光束，同时采用了去卷积算法，进一步提高显微系统的分辨率。

本发明的目的是这样实现的：

基于扫描振镜的单点去卷积显微系统，包括螺旋相位板、分光棱镜、偏振分束器、X轴扫描振镜、Y轴扫描振镜、扫描透镜、管镜、聚焦物镜、长波通滤光片、收集物镜和光电探测器；

第一平行光经过螺旋相位板调制后，依次经过分光棱镜和偏振分束器透射，X轴扫描振镜和Y轴扫描振镜反射，扫描透镜和管镜透射，由聚焦物镜汇聚在荧光样品上，形成环形光斑；

所述的螺旋相位板使第一平行光附加螺旋相位因子exp(ilθ)；其中，i为虚数单位，l为螺旋相位板的拓扑荷数，θ为旋转方位角；所述X轴扫描振镜由X轴电机带动、受X轴伺服系统控制，Y轴扫描振镜由Y轴电机带动、受Y轴伺服系统控制，X轴扫描振镜与Y轴扫描振镜相互配合，实现对样品进行XY面的逐点扫描；

第二平行光经过分光棱镜反射后，依次经过偏振分束器透射，X轴扫描振镜和Y轴扫描振镜反射，扫描透镜和管镜透射，由聚焦物镜汇聚在荧光样品上，形成圆形光斑；

所述第一平行光与第二平行光波长相同，在经过分光棱镜后同轴传递，将荧光样品表面激发出荧光，所述荧光依次经过聚焦物镜、管镜和扫描透镜透射，Y轴扫描振镜、X轴扫描振镜和偏振分束器反射，长波通滤光片透射，由收集物镜汇聚到光电探测器上进行成像。

上述基于扫描振镜的单点去卷积显微系统，所述的偏振分束器替换为二向色镜。

上述基于扫描振镜的单点去卷积显微系统，所述的长波通滤光片替换为带通滤光片。

上述基于扫描振镜的单点去卷积显微系统，所述长波通滤光片的截止波长λ选取应满足：λ₁＜λ＜λ₂，其中，λ₁为激发光波长，λ₂为荧光样品表面激发出的荧光波长。

一种在上述基于扫描振镜的单点去卷积显微系统上实现的成像方法，首先得到坐标为(i,j)的物点的灰度值sum_i,j，再通过调整X轴扫描振镜和Y轴扫描振镜的角度，遍历i和j的所有取值，利用所有物点的灰度值信息，构造完整的二维图像。

上述成像方法，所述的坐标为(i,j)的物点的灰度值信息，通过以下步骤得到：

步骤a、在只照射第一平行光，不照射第二平行光的条件下，光电探测器以坐标(i,j)为中心对荧光样品进行成像，得到分辨率为m×n的第一图像Image1_m,n；