[发明专利]卤蕨离体再生体系建立的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，是一种以孢子囊群为外植体的卤蕨离体再生体系建立的方法。

背景技术

卤蕨(AcrostichumaureamL.)为卤蕨科卤蕨属植物，分布于亚洲、非洲、美洲、大洋洲热带及亚热带地区。常生长于海边潮滩红树植物内缘或潮汐能至的堤岸边，是沿海滩涂的重要标志种。

卤蕨具较高的观赏价值。植株高大挺拔，可达2m。根状茎直立,顶端密被褐棕色的阔披针形鳞片。叶厚革质，簇生；基数一回羽状复叶，羽片多达30对，叶柄长30~60cm，粗可达2cm；叶片长60~140cm，宽30~60cm；叶脉网状，两面可见。孢子囊满布能上部能育羽片下面。卤蕨作为园艺物种栽培具有很大的发展潜力。

卤蕨的药用价值也很高。在民间卤蕨作为治疗创伤、止血、风湿、蠕虫感染、便秘、象皮病等的传统草药。卤蕨不仅具有良好的抗菌能力，而且具有很高的抗肿瘤活性。戴好富等(中国海洋药物杂志,2005,24(6):44-46)发现卤蕨的醋酸乙酯提取物活性较强,IC50达6.3μg/ml，抑制了HeLa细胞的生长活性。钟晓等(广西师范学院学报:自然科学2012,29(3):41-45)发现卤蕨的主要化学成分为甾体类、三萜类、黄酮类、苷类、单糖、氨基酸及硫酸酯类的化合物。这些化合物都具有一定的抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等生物活性。这些研究表明卤蕨是开发抗肿瘤药物和新型的抗菌药物的好材料。

卤蕨可在红树林生态恢复中可以发挥重要作用。在20世纪50~90年代，中国红树林面积锐减68.7%，现存林分中80%以上为退化次生林，立地环境恶化。目前用于红树林恢复的植物均是通过种子繁殖和胎生苗繁殖获得，作为真红树林植物中唯一的蕨类植物类群卤蕨属(Acrostichum)的运用很少见，这与卤蕨的种苗生产技术瓶颈有关，目前，尚未见有卤蕨离体再生体系建立方法的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种建立卤蕨离体再生体系的方法，即以卤蕨的成熟孢子囊群为外植体，经过外植体表面消毒、孢子无菌萌发、原叶体增殖、孢子体诱导、炼苗及移栽等步骤，建立卤蕨离体再生体系，实现卤蕨的快速繁殖目的。

本发明通过下述技术方案来实现。卤蕨(AcrostichumaureamL.)离体再生体系建立的方法，包括以下顺序步骤：

(1)外植体采集与表面消毒：剪取卤蕨孢子叶，进行表面消毒。

(2)孢子无菌萌发：分离孢子叶上的孢子囊群，将其接种于孢子萌发无菌培养基上进行培养。孢子萌发无菌培养基配方为：1/4MS基本培养基+0~20g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.2mg/L+琼脂7g/L。

(3)原叶体增殖培养：将步骤(2)得到的原叶体剪接到原叶体增殖培养基中进行原叶体增殖培养。每50d更换一次原叶体增殖培养基。原叶体增殖培养基配方为：1/4MS基本培养基+15g/L蔗糖+6-BA0~0.6mg/L+2,4二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.1mg/L+琼脂7g/L。

(4)孢子体的诱导：将步骤(3)形成的原叶体粉碎转接，诱导产生幼孢子体。孢子体诱导培养基配方为：1/4MS基本培养基+赤霉素(GA₃)0~1.2mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。

(5)生根培养与炼苗：将步骤(4)诱导的幼孢子体分离出来，转接诱导幼孢子体(幼苗)生根。培养基配方为：1/4MS基本培养基+15g/L蔗糖+2,4-D0.05mg/L或奈乙酸(NAA)0.05mg/L+琼脂7g/L。发现不定根根尖突出后，随即在培养室内松开、虚掩瓶盖，炼苗10d。

(6)移栽：取出步骤(5)的幼苗，洗去根部附着的凝胶培养基，将幼苗移栽入经高温灭菌的基质中。定期浇水，覆盖薄膜，保持相对湿度90%以上。