[发明专利]一种集提取、扩增和检测一体化的基因检测装置

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及医学的普通领域，尤其涉及在一便携式装置中提取核酸，扩增特异的靶核酸并检测扩增核酸序列的方法的领域。

背景技术

由于对传染病和新出现疾病、生物威胁试剂、遗传病和致病因子的环境储库的公共健康影响和认识已经增加了，因此，对于更加信息化、灵敏和特异性的使用快速测定的需求已使得对检测样本工具的要求增加。目前，通过传统的核酸提取方法提取核酸，通过PCR的扩增的方法进行的分子检测是非常灵敏的、特异性的和信息化的。不幸的是，目前可用的提取核酸和核酸检测方法不适合在取样现场使用或在取样现场使用的实用性有限，原因在于其需要精巧的、笨重且昂贵的仪器、专业的实验室材料和/或依赖于使用者干预的多个操作。因此，大部分用于分子检测的样品被装运到集中式实验室，这导致获得所需要的信息需要长的周转时间。

尽管目前研究开发了一些涉及检测扩增的靶序列自动化系统，但目前的技术包括三个步骤。

第一步，核酸提取：

1869年，瑞士医师Friedrich Miescher首例成功的进行了核酸提取。起初，他关注于组成白细胞各种蛋白质，并指出蛋白质是细胞质的主要成分。但在随后的测试试验中发现，当加入酸性溶液时溶液中生成一种沉淀物，再加入碱性溶液时沉淀继而溶解消失。Miescher首例提取出粗糙的DNA，Miescher成功从细胞中提取出DNA后，一些研究者纷纷效仿，并在材料、试剂的应用上进行了不断的探索，由此发展了许多核酸的生物分子提取技术。现如今，从硫氰酸胍盐-苯酚-氯仿提取法到柱纯化技术，已被广泛地用于DNA和RNA的提取。提取方法主要包括以下几种：

1.胍盐裂解法

胍盐是蛋白强变性剂，核酸提取一般采用高浓度的胍盐来裂解细胞，促使核蛋白体解离，同时高浓度的胍盐能使细胞内核酸酶失活，使释放出的核酸不被降解。1977年，Ulrich 等首次使用异硫氰酸胍从总RNA中分离纯化出mRNA。该方法特点是利用多数真核细胞中 mRNA 的3'端有 polyA 尾巴，使用oligo（dT）—纤维素亲和层析法，从总RNA中分离纯化出mRNA，但此方法费时费力。在 Ulrich 研究的基础上，1979年 Chirgwin 等[4]发明了一种破裂细胞膜但不破坏核苷酸的方法，即先将组织在异硫氰酸胍和β-巯基乙醇中混合均匀，然后通过乙醇抽提或氯化铯梯度超速离心来分离纯化细胞中的RNA。该技术是首次能特异性分离RNA 的方法，但还是存在诸多缺点，比如耗时长、效率低，并且由于采用苯酚等毒性有机溶剂，操作有一定的风险性。到目前为止，虽然在此基础上发展出了很多核酸提取技术，但均没有克服耗时长、危险性大等诸多弊端。

2.CTAB裂解法

1980年，Murray和Thompson 发明了一种方法 ：使用溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）法可快速提取高纯度的大分子量植物DNA。经液氮研磨样品后，用适当体积的 CTAB 缓冲液重溶样品。CTAB是一种非离子型去垢剂，它能使核酸和酸性的多糖从低离子强度的溶液中沉淀出来。同时，蛋白质和中性多糖等杂质留在溶液中。CTAB 裂解法对产生大量多糖的生物体的核酸提纯非常有用的，如植物和某些革兰氏阴性菌，但这种方法的缺点是：实验步骤多，操作较繁琐。

3.酚抽提法

苯酚作为蛋白变性剂，能使蛋白质快速变性，因此，可用来提取基因组DNA：先用 EDTA 和 SDS 为主的裂解缓冲液裂解细胞，再经蛋白酶 K 处理后，然后用pH8.0 的 Tris 饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需的核酸DNA。此法的优点是提取的DNA保持天然状态，且纯度高，可满足临床各种检测所需；缺点是操作繁琐，比较费时，而且使用毒性有机溶剂苯酚对试验人员有一定的危害。

由上所述，现有技术提取核酸存在实验步骤多、操作较繁琐、危险性大等缺点。

第二步，靶核酸扩增：

核酸研究已有100多年的历史，20世纪60年代末、70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术，1983年美国科学家Kary Mullis驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶，孕育出了PCR的雏形。经过两年的努力，在实验上证实了PCR的构想，并于1985年申请了有关PCR的第一个专利，在science杂志上发表了第一篇PCR学术论文。从此PCR技术得到了生命科学界的普遍认同。Kary Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。