[发明专利]一种检测羊泰勒虫和无浆体的双重PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测羊泰勒虫（Theileriaspp）和无浆体（Anaplasmaspp）的双重PCR方法。

技术背景

羊泰勒虫病是由羊泰勒虫属病原引起的绵羊和山羊的一种蜱传性血液原虫病。该病最早于1914年由Jittlewood发现于埃及的绵羊，杨辅国等在中国首次报道。在某些地区，羊泰勒虫感染率高达95％，病羊表现高热、体表淋巴结肿大、贫血和消瘦等症状，严重时导致死亡，给我国养羊业造成很大危害。羊无浆体病（俗称边虫病）是由无浆体属的病原引起的蜱传性血液立克次体病，绵羊和山羊感染时主要表现高热、贫血、黄疸和渐进性消瘦等，严重感染时可导致死亡，其中嗜吞噬细胞无浆体作为一种人和多种动物的人兽共患病病原，具有公共卫生学意义，受到人们的高度重视。我国自1982年在新疆绵羊体内发现羊无浆体以来，目前很多地区均有报道。

目前，血液原虫诊断方法主要有涂片染色镜检、酶联免疫吸附试验(ELISA）、间接荧光抗体试验(IFA)、聚合酶链式反应（PCR）等。其中使用最广泛的是涂片染色镜检，该方法设备简单、操作简便，但是检测率低，适合于病畜的检测，但在检测无症状感染（带虫）时则易出现假阴性或假阳性。Glen等（2007）证实了ELISA方法能够有效且可靠的诊断家养羊的绵羊无浆体病和野生有蹄类动物的无浆体病。赵帅阳（2014）以中华泰勒虫MSP重组蛋白为抗原建立了牛泰勒虫间接ELISA方法。ELISA方法只能说明被检动物是否感染过某种病原，不能检测到当时是否正处于感染状态。Ogunremi报道了间接荧光抗体试验和补体结合试验用于检测马泰勒虫。间接荧光抗体试验和补体结合试验方法操作繁琐，不宜用于大批量样品的检测。

单PCR扩增结合测序方法临床上用于多种寄生虫的敏感性和特异性的检测。羊泰勒虫和无浆体都是以硬蜱为媒介在羊中传播的，因此在一些地区混合感染两种病原的现象很常见。Renneker等报道，在检测的195份羊血液中有45份混合感染羊无浆体、泰勒虫、巴贝斯虫，感染率达到23%。目前，多采用单PCR检测某种病原，其优点是可以分别设定反应参数保证扩增效率较高，且能分别检测相近大小的病原或基因，但单PCR一次只能检测一种病原或一个基因，当需检测多种病原或多个基因，或检测未知病原体的混合感染时，应用单PCR方法对单一病原的检测需多次扩增筛选，费时费力，且成本大大增加。Alhassan等根据18SrRNA基因的特征设计特异性二重PCR引物，可同时鉴别扩增马巴贝斯虫和驽巴贝斯虫。多重PCR反应可节约试剂、反应时间和电泳时间，同时各对引物在扩增时的竞争使检测具有较低的假阳性率。因此，与单PCR方法相比，多重PCR方法具有更准确、高效、经济的特点。

中国发明专利201510101859.6建立了多重PCR方法检测与区分牛环形泰勒虫和东方泰勒虫；专利201410476184.9建立了检测所有泰勒虫的引物、探针及试剂盒和扩增体系，用来检测所有泰勒虫；20131010195.5建立了多重PCR鉴定试剂盒用于鉴定羊吕氏泰勒虫、羊尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫；201410332786.7采用LAMP技术检测牛无浆体；201210137237.5建立了检测绵羊无浆体的试剂盒。目前，有关同时检测泰勒虫和无浆体的方法尚未见报道。本试验所建立的双重PCR方法具有特异性强、敏感性和重复性好、样品用量小、节省时间和费用等优点，对于Theileriaspp和Anaplasmaspp流行病学调查和病原鉴定具有重大意义。

发明内容

针对目前羊泰勒虫和无浆体的检测方法检出率低、操作繁琐等问题，本发明依据羊泰勒虫18SrRNA和羊无浆体16SrRNA基因保守序列为靶基因位点，建立了一种能同时快速检测检测羊泰勒虫（Theileriaspp）和无浆体（Anaplasmaspp）的双重PCR方法。该法以具有快速、特异、灵敏、高效、低成本等特点，为羊泰勒虫病和无浆体病的快速诊断及流行病学调查提供了适用先进技术。

本发明提供一种检测羊泰勒虫和无浆体的双重PCR方法，包括以下步骤：

（1）引物设计

根据GenBank登录号：AF081136.1、KJ188221.1、AY260172.1、AF081137.1、U97052.1，用DNAMAN软件比对羊泰勒虫18SrRNA基因序列，找到基因保守序列靶基因位点，设计了特异性引物序列I为：上游引物Tf：5'ATTCCCGCATCCTATTTAGCAG3'和下游引物Tr：5'CGACTCCTTCAGCACCTT3'；