[发明专利]髓核-软骨细胞外基质支架及其制备方法

权利要求书

1.一种髓核-软骨细胞外基质支架，其特征在于：所述支架是由冻干的脱细胞髓核基质与冻干的软骨细胞外基质按照1:10~10:1的比例混合溶解，冻干后通过物理、或化学或物理与化学联合的方式交联而成的三维多孔海绵状结构。

2.一种权利要求1所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

①脱细胞髓核基质的制备

a.将椎间盘髓核组织在0~4℃下浸泡于含有蛋白酶抑制物的Tris-HCl缓冲液中振荡8~48h；

b.粉碎，采用密度梯度离心法获取直径为100nm-5μm的髓核基质微丝；

c.将髓核基质微丝放入含0.5~2%TritonX-100和0.35~1.0%脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液，0~4℃下振荡12～72h；

d.无菌超纯水清洗，用含有DNaseⅠ和RNaseA的无菌PBS缓冲液37℃下振荡消化8～48h；

e.无菌超纯水清洗，获得脱细胞髓核基质微丝悬液，冻干，冷藏备用；

②脱细胞软骨基质的制备

a.取骨关节面软骨，浸泡于含蛋白酶抑制物的无菌PBS缓冲液中振荡8h~48h;

b.粉碎，密度梯度离心获取直径为100nm-5μm左右的软骨基质微丝；

c.将软骨基质微丝放入含蛋白酶抑制物和0.5~2%TritonX-100的Tris-HCl缓冲液中，0~4℃下振荡12～72h；

d.无菌超纯水清洗，用含DNaseⅠ和RNaseA的无菌PBS缓冲液37℃振荡消化8～48h；

e.无菌超纯水清洗，获得脱细胞软骨基质微丝悬液，冻干，冷藏备用；

③支架的构架和交联

a．按质量比为冻干的脱细胞髓核基质：脱细胞软骨基质=1:10~10:1的比例称取以上两种物质并溶于去离子水中，配成质量体积比为0.6%~6%的乳悬液；

b．将上述乳悬液注入模具中，排出模具中的气体；

c．放入-20~-80℃冷冻1~48h；再放入冷冻干燥机中，待其完全冻干；

d.将冻干的样品在碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中交联1h～48h；或将冻干的样品在京尼平溶液中交联1h~48h；或将冻干的样品在醛类化合物溶液中交联1h～48h；或将冻干的样品置于紫外线下交联；或将冻干的样品先经紫外线照射后采用化学试剂联合交联；

e．获得的样品进行清洗，烘干，灭菌。

3.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：所述步骤①a、c、d和步骤②c、d中振荡频率为80~250r/min。

4.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：所述步骤①a中Tris-HCl的浓度为50mmol/L，pH7.5；步骤①a和②a、c中蛋白酶抑制物为苯甲基磺酰氟，浓度为0.020~0.050mmol/L。

5.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：步骤①d和②d中DNaseⅠ和RNaseA的浓度分别为0.72~50U/ml、0.72~1U/ml。

6.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：步骤③d中碳化二亚胺的浓度为0.001～1m/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.001～1m/L。

7.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：步骤③d中京尼平溶液的浓度为1%~2%。

8.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：步骤③d中醛类化合物溶液的浓度为0.01%～2.5%。

9.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：步骤③d中紫外线波长为258nm，距离光源5～10cm，交联时间15min～8h。