[发明专利]基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法

权利要求书

1.一种基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)农杆菌菌液培养

将农杆菌菌液在YEB固体培养基上划线后挑取单菌落在YEB液体培养基中摇菌培养，YEB液体培养基中添加卡那霉素25～50mg/L和利福平50～100mg/L，在28℃的条件下，180～200rmp振荡培养约12～16小时至OD600为0.4～0.8，将50mL菌液在离心机中5000rmp离心后倒去上清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定OD600在0.4，将重悬后的菌液放于0～4℃的冷藏环境下备用；所述农杆菌菌液选用根癌农杆菌C58、AGL0和EHA105；

(2)农杆菌注射

步骤(2)将番茄果实按照不同的发育时期分为五个不同的时期，其中前两个时期为番茄果实绿果期，第一个时期为果实刚刚形成，果实直径大约3～5毫米，为小绿果；第二个时期为果实发育一段时间后果实直径大约5～8毫米，为大绿果；第三个时期为番茄果实开始从绿果向白果转化，果实变白，为白果期；第四个时期是番茄果实由白变黄，为黄果期，直至果实完全变为黄色；第五个时期为红果期，果实完全为红色；

选取不同成熟期的果实进行注射，注射农杆菌悬浮液至果实中，从果柄处注入菌液，每次注射20微升，每天注射一次，一共连续注射三天；

(3)gus组织染色检测

分别在注射后第三天、第五天、第七天将注射后的果实摘下，用刀片切成1～2毫米的薄片，放入gus染色液中，进行染色鉴定，染色过夜后用70％酒精去除叶绿素后统计转化效率，转化效率以gus染色率来表示，在染色后的果实薄片中，以蓝色占果面50％以上为准统计出具有gus基因瞬时表达的数量也就是gus染色率：

gus染色率＝(染色的果实数量/总注射果实数)×100％；

(4)gus基因表达量检测

取注射后第五天果实，提取果实RNA，反转录为cDNA后进行荧光定量PCR，检测gus基因表达量。

2.根据权利要求1所述的基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法，其特征在于：所述YEB液体培养基的配方中包括：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.5g/L。