[发明专利]一种GFP多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及一种GFP多克隆抗体的制备方法。

背景技术

绿色荧光蛋白(greenfIuorescentprotein，GFP)是由238个氨基酸组成的单体蛋白，1974年由Movie等首先从海洋生物水母中分离出来。GFP可作为一种报告基因，广泛用于蛋白质的定位、转运以及蛋白间互作、信号转导，病原检测，以及蛋白的分离与纯化等等方面。近年来，由于检测技术和仪器的发展，利用GFP融合蛋白，可以有效的分析蛋白数量、定位以及动力学特征。用GFP的荧光对蛋白进行有效分析的同时，由于融合了外源的GFP蛋白，也会存在其荧光容易淬灭、漂白和定位错误等一系列问题，因此制备高特异性与高灵敏度的GFP抗体，会提高GFP荧光的检测范围、灵敏度和准确度，是一种有效的补充手段，可以对荧光数据进行有效的辅助说明。

另外，其他生物学过程如DNA结合、酶的活性，复合体的形成等需要如ChIP(chromatinimmunoprecipitation)和亲和纯化(affinitypurification)等实验方法，这些实验手段会受到抗体的特异性、灵敏度等影响，研究者往往通过对目的蛋白融合标签蛋白，来解决这个问题。通常所用到的标签蛋白如c-Myc、FLAG、GST等，奇怪的是，作为最为常用的标签GFP蛋白，虽然发明了其单抗与多抗，但生化分析中却很少被报道。这可能由于GFP抗体的效价与特异性低导致的结果，因此对于发明一种高效价、高灵敏性的GFP抗体就显得尤为重要。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种GFP多克隆抗体的制备方法，旨在解决以往研究中的GFP抗体特异性不高、抗体效价低的问题。

本发明所提供的GFP多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

首先用DNAstar软件对GFP蛋白进行抗原预测分析，选择亲水性强，抗原性指数高的两段区域作为抗原区，然后通过设计引物，用含有GFP核苷酸序列的pCAMBIA1300质粒做模板，进行扩增；

把抗原基因片段连接到pET28a载体上，重组质粒转化入BL21中，筛选阳性克隆并PCR鉴定；

选用日本大耳白兔，一组二只，在注射抗原的同时，加入免疫佐剂刺激机体产生较强的免疫反应，对多克隆抗体兔进行双肩皮下两点和双后腿肌肉两点常规免疫；

采用A蛋白或G蛋白纯化IgG抗体。

进一步，模板质粒为：GFP双源表达载体。

进一步，筛选阳性克隆并PCR鉴定具体方法如下：BL21菌液转接到1LLB培养基中，100r/min，37℃摇菌到OD值为0.8；然后加入IPTG至终浓度为20μmol/L，16℃摇菌过夜；离心收菌体后，按照每100mL菌液加4mLbindingbuffer，并加入Lysome至终浓度1mg/mL，室温摇床上摇至30min，4℃静置10min，进行超声波破碎，超声15s，间隔15s。

进一步，从A蛋白和G蛋白柱上洗脱抗体时，需在4℃冷库进行，用proteinA/G对抗体进行纯化。

本发明的另一目的在于提供一种所述多克隆抗体的制备方法在免疫组化的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述多克隆抗体的制备方法在细胞学检测的应用。

本发明首先对GFP蛋白全长的抗原性进行分析，选择两段高亲水性区段，构建融合蛋白，并进行原核表达；经过四次免疫后，经平行对照比较，所制备的抗体具有效价高，灵敏性好，可重复等优点，可以有效弥补现有GFP抗体的缺点和不足。本发明通过分析GFP蛋白全长的疏水与亲水结构域，然后选择高度亲水区的两个个区段作为抗原序列，进行蛋白表达，可以有效降低抗体的非特异性，选择两个个区段作为抗原，可以提高制备抗体的效价；所优化的实验体系，也适合于其他高效价、高灵敏度的蛋白抗体制备。

附图说明

图1是本发明实施例提供的GFP多克隆抗体的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的抗原区段的选择示意图。

图3是本发明实施例提供的蛋白表达纯化示意图。

图4是本发明实施例提供的抗体验证比对示意图。

图5是本发明实施例提供的活体细胞标记示意图。

图6是本发明实施例提供的免疫胶体金标记示意图。

具体实施方式