[发明专利]一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂，其特征在于，是由特定方法制备的干细胞、人血白蛋白，低分子肝素钙，复方氨基酸，维生素C，无酚红的DMEM/F12培养基、白介素3（IL-3），重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF），白介素11（IL-11），促红细胞生成素（EPO），干细胞因子(SCF)及人促血液血管生长素(HAPO)，按一定比例配制而成；

其中，所述的特定方法制备的干细胞的具体制备步骤如下：

（1）取P3~P6代的间充质干细胞，首先进行流式细胞鉴定，标记物CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达在90%以上；不表达CD34、CD45，在5%以下；

（2）将上述步骤（1）中鉴定后的干细胞以2×10⁴个/ml的浓度混匀于培养基A中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养，培养第2天换液，以后每2天换液1次；

（3）当上述步骤（2）中细胞培养融合至80%-90%时，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37℃条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以2×10⁴个/ml的浓度混匀于培养基B中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养，培养第2天换液，以后每2天换液1次；

（4）当上述步骤（3）中细胞培养融合至80%-90%时，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37℃条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以5×10⁵个/ml的浓度混匀于培养基C中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养48~72h，培养第2天换液；

（5）将上述步骤（4）特殊培养后的干细胞，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37℃条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以1000r/min离心10分钟，弃去上清液并以生理盐水重悬，以1000r/min离心10分钟后弃去上清液，收集沉淀的干细胞备用。

2.根据权利要求1所述的一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂，其特征在于，所述的特定方法制备的干细胞的具体制备步骤（2）中培养基A的组成是：含10%胎牛血清、1×双抗的DMEM/F12培养基；步骤（3）中培养基B的组成是：含75μg/Lγ干扰素（INF-γ），75μg/L肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、15mg/L碱性成纤维生长因子(bFGF)、15mg/L表皮生长因子(EGF)、5g/L牛血清白蛋白（BSA）、1.5mg/L还原型谷胱甘肽、1×胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、0.05mmol/Lβ-巯基乙醇、10mg/L氢化可的松、100nmol/L地塞米松和1%非必须氨基酸的无血清DMEM/F12培养基；步骤（4）中培养基C的组成是：含质量体积比为（1~5）%的人血白蛋白、质量体积比为0.5%的低分子肝素钙、质量体积比为（1~20）%的复方氨基酸、质量体积比为（0.3~0.7）%的维生素C、20ng/ml的白介素3（IL-3）、20ng/ml的重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、30ng/ml的白介素11（IL-11）、3U/ml的促红细胞生成素（EPO）、50ng/ml的干细胞因子(SCF)和3U/ml的人促血液血管生长素(HAPO)以及（60-90）μmol/L的氯化钴（CoCl₂）的无血清DMEM/F12培养基。

3.根据权利要求1所述的一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂，其特征在于，所述的特定方法制备的干细胞的具体制备步骤（4）中培养基C的优选组成是含质量体积比为5%的人血白蛋白、质量体积比为0.5%的低分子肝素钙、质量体积比为10%的复方氨基酸，质量体积比为0.5%的维生素C、20ng/ml的白介素3（IL-3）、20ng/ml的重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、30ng/ml的白介素11（IL-11）、3U/ml的促红细胞生成素（EPO）、50ng/ml的干细胞因子(SCF)和3U/ml的人促血液血管生长素(HAPO)以及75μmol/L的氯化钴（CoCl₂）的无血清DMEM/F12培养基。

4.根据权利要求1所述的一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂，其特征在于，所述的特定方法制备的干细胞的具体制备步骤（1）中的间充质干细胞的来源优选骨髓、脐带和胎盘。