[发明专利]利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程，具体是涉及一种利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法。

背景技术

成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,简称FGF)是一类结构类似、生物功能相近的肝素结合蛋白，目前共分离鉴别出23种FGFs，碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,简称bFGF)是FGFs家族的主要成员之一，具有广泛的生物学活性，可刺激血管内皮细胞和成纤维细胞的增殖，对许多细胞有化学催化作用，诱导内皮细胞合成胶原酶和纤溶酶原激活因子，在体内诱导血管形成，还能促进软骨、骨组织及神经组织的损伤修复，促进肢体再生，对大脑皮层、中脑和小脑神经元均有促活作用，除用于医疗外还被大量的运用于美容和整形，显示出广阔的应用前景。

天然的bFGF来源于垂体等组织中，含量极少，难以大量制备。运用基因工程在大肠杆菌中发酵生产是常用的最为经济和可持续的方法。然而在大肠杆菌中bFGF以包涵体的形式表达，需要重折叠以恢复生物活性，而非融合的bFGF在大肠杆菌中的表达量过低。而公开号为CN1594565A的专利使用家蚕表达bFGF，每头家蚕产量仅600～700μg，且生产周期过长；公开号为CN1345927A的专利使用酵母发酵表达bFGF，其产量低，仅20～100mg/L。公开号为CN102675473A的专利融合bFGF与人胶原蛋白，其医疗方面的应用受限制。公开号为CN103882028A的专利融合PDI辅助可溶性表达，但未提及表达量。

SUMO(SmallUbiquitin-likeModifier)是一种小分子泛素样修饰蛋白，广泛存在于各种真核细胞中，参与调节细胞凋亡、信号转导、RNA转录、蛋白的核质运输以及细胞周期等多种生理进程。近年来发现SUMO可作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，具有抗蛋白酶水解、显著增加重组蛋白表达量、促进靶蛋白正确折叠、提高可溶性等功能。目前尚未见有利用SUMO促进bFGF高效表达的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法。

本发明包括以下步骤：

1)工程菌构建：

bFGF的原始基因序列如SEQIDNO.1，氨基酸序列如SEQIDNO.2，原始基因序列中存在Ncol酶切位点，故将其第6位的C突变成A，其氨基酸序列仍保持不变，全序列合成优化后的基因序列如SEQIDNO.3。

SUMO蛋白酶ULP1在SUMOC端Gly-Gly后酶切，且经实验证明，Gly-Gly后为Met也不影响酶切；由于不存在合适的限制性内切酶酶切位点，因此使用overlapPCR将SEQIDNO.3序列与SUMODNA序列拼接，并在拼接序列两端设计Ncol和Xhol酶切位点，拼接序列内部并无这两内切酶酶切位点，最终得到的序列为SEQIDNO.4；使用Ncol和Xhol酶切拼接序列与质粒pRSFD连接；设计引物如下：

PartA：

模板：pSUMO

UpprimerforpSUMO-Ncol:CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCA

bFGFDownprimerforA:CCGCCGCCATTGTGCCTCCACCAATCTGTTCTC

PartB:

模板：bFGFgene

bFGFUpPrimerforB:AACAGATTGGTGGAGGCACAATGGCGGCGGGCAGCATTA

bFGFDownprimerforB-Xhol:CCGCTCGAGTTAGCTTTTCGCGCTCATCGGCA

将构建好的质粒pRSFD-SUMO-bFGF转化至感受态细胞E.ColiBL21(DE3)中；

2)工程菌发酵：

将构建好的工程菌涂布在有Kana霉素的LB平板上选育菌种，在液体培养基中发酵培养，加诱导剂IPTG诱导表达，离心收集菌体。

3)纯化：

裂解菌体，离心收集上清液，SUMO蛋白N端前段有His-Tag，可以被Ni胶亲和吸附，将上清液与Ni胶混合使之结合到Ni胶上，加入SUMO蛋白酶ULP1酶切，因为SUMO与ULP1都有His-Tag，都可以被Ni胶特异吸附而bFGF不能被吸附，所以可用砂芯漏斗将之过滤出来；