[发明专利]一种细胞分选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种细胞分选方法。

背景技术

随着细胞替代治疗的发展，干细胞移植治疗已成为临床上治疗某些疾病的重要手段，利用干细胞在体外扩增培养并诱导成所需要的细胞后移植入患者体内，用于组织损伤的修复、退行性器官的替代及改善遗传性缺陷组织器官的功能。而成体干细胞可塑性分化的发现，为细胞替代治疗提供了新的方向。尽管在细胞治疗领域已取得一些列进展，但仍存在重大挑战。要达到治疗疾病的目的就必须要获得治疗目标疾病所需的精确细胞群，一旦进行移植，要确保这些细胞达到需要它们的位点，整合到现有组织中。细胞纯度是细胞治疗面临的技术问题之一。

细胞分离（cellisolation），指的是将组织分散制成细胞悬液后从中获取目的细胞的过程。而所谓细胞纯化更进一步强调从原代培养成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞的分离和纯化过程，是培养物成为单一类型培养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后者即细胞系。分离和纯化两个概念之间没有截然的界限，许多情况下，细胞分离和纯化并不是完全彻底的，培养物种只能达到以某种细胞为主的程度，所以也称为富集（enrichment）。分离和纯化细胞的过程不仅仅在原代培养之前进行的，有时分离和纯化细胞的过程还贯穿于原代培养之和继代培养的过程中，甚至是主要依赖培养过程实现分离和纯化细胞的目的。培养物种细胞成分是否单一或者目的细胞在培养物中的比例如何，常是衡量某一培养工作是否成功的重要指标。细胞的分离纯化包括密度梯度离心技术、逆流淘析分离技术、利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法等，其中前两种方法并没有使目的细胞群相对于有核细胞发生太多的富集。细胞的可逆分选是指能够将细胞从分选载体上释放出来的细胞分选方法，近年来，虽然已有利用适配体和温敏聚合物来可逆分选癌细胞的报道，但关于干细胞的可逆分选仍属空白。

细胞治疗在机体生长、发育及器官组织修复过程中已表现出巨大的潜力，在临床应用上前景也十分广阔，因此解决细胞纯度问题将有助于细胞治疗的临床发展。

发明内容

本发明提出一种细胞分选方法，将海藻酸的自组装系统、生物素-链霉亲和素系统、抗原-抗体系统相结合，在生物素标记的抗体识别目的细胞后与链霉亲和素标记的磁珠形成细胞-磁珠复合物后，通过与离子螯合剂EDTA的孵育使海藻酸钙解体，从而使磁珠与细胞分离，磁性富集后去除磁珠，得到不含磁珠的目的细胞，经过大规模培养后获得数量和纯度均达到移植要求的细胞。

本发明的技术方案是这样实现的：一种细胞分选方法，包括：与细胞表面抗原特异结合的抗体，功能性磁珠，所述抗体为生物素标记的抗体，所述功能性磁珠为标记了链霉亲和素的磁珠，利用海藻酸的自组装、生物素结合链霉亲和素以及细胞表面标志，进行细胞的分选。

优选的，包括以下步骤：

A、所述抗体进行生物素标记；

B、所述磁珠进行链霉亲和素标记；

C、标记后的所述抗体与细胞孵育；

D、经过步骤C处理后的细胞与经经过步骤B处理的磁珠进行孵育；

E、磁性富集经过步骤D处理的细胞；

F、向经过步骤E处理的细胞中加入EDTA，孵育后收集上清获得不含磁珠的目的细胞。

优选的，步骤A中，包括：将所述抗体与适量活化的生物素混合，室温孵育，室温30min为宜。

为增强实验的效果，采用超滤管对步骤A中得到的混合液进行清洗，除去多余的生物素。

优选的，步骤B中，包括：海藻钠的活化后标记链霉亲和素、链霉亲和素-海藻酸-磁珠复合物的形成。

优选的，步骤B中，海藻酸用EDC/NHS活化半小时后与链霉亲和素在4℃孵育4小时。

优选的，步骤B中，包括：磁珠与海藻酸混合后滴加入氯化钙溶液中，形成通过钙离子交联海藻酸将磁珠包裹在海藻酸钙中，形成海藻酸-磁珠复合物，然后与链霉亲和素标记的海藻酸混合，同样通过钙离子的交联作用形成链霉亲和素-海藻酸-磁珠复合物，完成磁珠的链霉亲和素标记。

优选的，步骤C中，包括：细胞消化成单个细胞后与经过步骤A处理的抗体孵育，孵育结束后用TBS溶液对细胞进行3次清洗，离心收集细胞沉淀。

优选的，步骤D中，包括：将步骤C中的细胞沉淀与经过步骤B处理的磁珠进行孵育，得到细胞-磁珠复合物。

优选的，步骤E中，包括：将步骤D中所述细胞-磁珠复合物通过磁性富集分离，并用TBS进行3次清洗