[发明专利]检测DERA酶催化醛缩反应液中氯乙醛含量及催化效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶催化效率的检测方法，具体涉及一种检测DERA酶催化醛缩反应液中氯乙醛含量及催化效率的方法。

背景技术

他汀类药物是降血脂主要药物，其结构中均带有侧链(3R，5S)-二羟基酯结构，该结构可作为甲羟戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，抑制HMG-CoA向甲羟戊酸的还原性转化，进而降低低密度脂蛋白胆固醇的水平，从而达到降低血脂的目的。

他汀类药物虽然化学结构相对简单，但其制备过程难度较大，原因有两个，一是侧链(3R，5S)-二羟基酯具有2个手性中心，难以通过一步反应完成；二是侧链(3R，5S)-二羟基酯在他汀类分子中的对映体过量(e.e.)和非对映体过量(d.e.)值分别大于99.5％和99％，使得对映体的拆分比较困难。这些因素都导致他汀类药物侧链合成产率较低，成本较高。

生物催化是解决当前问题的重要途径。目前，已经发现有生物酶对羟醛缩合反应有催化效果，其中醛缩酶DERA能够催化乙醛和氯乙醛的连续醛缩反应，生成带有两个手性中心的6-氯-(3R，5S)-二羟基醛，在他汀类药物合成中具有巨大的潜在应用价值。

但不同的生物酶，甚至不同来源的DERA酶，对连续醛缩反应的催化效果均不相同。在寻找催化效果更佳的DERA酶的过程中，就需要对其产物进行检测，以评价DERA酶的催化效率。然而，由于利用DERA酶催化连续醛缩反应时，对其产物的检测非常困难，一般需要用到气相色谱等仪器，对仪器要求高，检测成本高，从而严重限制了改进DERA酶催化性能的研究。

通过检测DERA酶催化连续醛缩反应的上清液中未反应底物的含量，可以得出参与催化反应的底物的消耗量，从而可获得DERA酶的催化效率。

对于甲醛、乙醛等羰基化合物的检测方法，一般是先将甲醛在酸性条件下与2，4-二硝基苯肼反应，生产稳定的2，4-二硝基苯腙；然后可经环己烷萃取，用配有电子波或检测器的气相色谱仪测定2，4-二硝基苯腙的含量，得出甲醛的含量；还可将2，4-二硝基苯腙置于碱性条件下生成有色的醌类化合物，并在430nm左右波长下利用比色法测定醌类化合物的吸光度，也可以计算出甲醛的含量。

但DERA酶催化连续醛缩反应的反应体系中，含有乙醛和氯乙醛两种羰基化合物，乙醛和氯乙醛均能依次与2，4-二硝基苯肼、碱液发生反应，生成棕红色化合物。在测量含有两种棕红色化合物的样本待测液的吸光度时，本发明人发现，在430nm左右波长下测量时，检测结果极不稳定，准确率较差。

发明内容

本发明提供了一种检测DERA酶催化连续醛缩反应液中氯乙醛含量的方法，该方法具有检测结果准确、检测灵敏度高等特点。

一种检测DERA酶催化连续醛缩反应液中氯乙醛含量的方法，包括以下步骤：

(1)取反应上清液，加入2，4-二硝基苯肼，在酸性条件下进行反应，获得样本反应液；

(2)向样本反应液中加入碱液继续反应，获得样本待测液；

(3)在520～535nm波长下测量样本待测液的吸光度，根据标准曲线计算反应上清液中氯乙醛的含量。

传统方法在检测溶液中羰基化合物的含量时，一般是在430nm左右波长下测量样本待测液的吸光度。但本发明的上清液中含有乙醛和氯乙醛两种羰基化合物，乙醛和氯乙醛均能依次与2，4-二硝基苯肼、碱液发生反应，生成棕红色化合物。在测量含有两种棕红色化合物的样本待测液的吸光度时，发明人发现，在430nm左右波长下测量时，检测结果极不稳定，准确率较差。这是因为乙醛参与反应生成的棕红色化合物A，其特异性吸收峰在438nm处，而氯乙醛参与反应生成的棕红色化合物B，其特异性吸收峰却在520～535nm，这是出乎本领域技术人员常规认知之外的。同时棕红色化合物B在430nm波长下也具有与棕红色化合物A相近的吸收峰，两者的吸收峰彼此覆盖，使得在430nm左右波长下测量样本待测液的吸光度时，测量结果不准确。而本发明在520～535nm下测量样本待测液的吸光度，在该波长下只有棕红色化合物B的吸收峰，测量结果稳定、准确率和灵敏度均大大提高。

具体地，所述方法包括：

(1)取反应上清液，加入2，4-二硝基苯肼，在酸性条件下进行反应，获得样本反应液；

作为优选，2，4-二硝基苯肼的终浓度为0.0025％～0.005％，更为优选的终浓度为0.005％。根据本领域技术人员的常规认知，2，4-二硝基苯肼的加入量应为过量，大于反应液中乙醛与氯乙醛的总量。