[发明专利]一种改造枯草芽孢杆菌菌株的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种改造枯草芽孢杆菌菌株的方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有非致病性和分泌蛋白能力强等特性，广泛运用于农业、医药和工业酶制剂等领域。利用枯草芽孢杆菌生产的酶制剂有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和纳豆激酶等，提高其发酵酶活力常用的方法有理化诱变筛选新菌株或是利用基因工程手段增加相关目的基因的表达。因而深入了解枯草芽孢杆菌胞外酶合成的调节机制，对枯草芽孢杆菌高产酶菌株的选育将大有裨益。

已有研究认为，枯草芽孢杆菌胞外酶的大量合成是在细菌生长经过对数生长期后菌体生长进入减速期和随后的稳定期内发生的。然而，在细菌生长进入稳定期后，菌体细胞会先后启动芽孢形成相关基因的表达，而先期启动芽孢形成相关基因表达的细胞，同时也会启动产孢致死因子（sporulation killing factor，Skf）基因（skf）的表达，从而杀死那些尚未启动芽孢形成相关基因的菌体和对skf表达敏感的营养细胞，以使先期启动芽孢形成相关基因表达的细胞获得足够营养并延迟芽孢的形成，这一结果最终导致活体细胞数目和菌体生物量的降低，这种现象称为同类相残。正是由于这一现象的存在，使得枯草芽孢杆菌胞外酶产量受到了根本限制，而目前尚无较好的改进方式。

发明内容

在对现有同类相残现象研究基础上，本发明提出了一种改造枯草芽孢杆菌菌株的方法，该方法主要是通过基因工程手段敲除产孢致死因子基因（skf）从而构建新的产酶菌株从而规避同类相残现象发生，同时具有较好提高枯草芽孢杆菌胞外酶产量的效果。

本发明所采取的技术手段详细介绍如下。

一种改造枯草芽孢杆菌菌株的方法，该方法包括如下步骤：

（1）人工构建不含（敲除）产孢致死因子基因（skf）的基因序列，

所述不含（敲除）产孢致死因子基因（skf）的基因序列，3173bp，由3部分DNA片段组成，分别是skf上游部分序列（片段A，SEQ ID NO.1）、四环素抗性基因表达序列（片段B，SEQ ID NO.3）、skf基因下游部分序列（片段C，SEQ ID NO.2）；（需要说明的是，序列表中序列有重叠部分，具体计算时需要去除两条序列中其中一条相互重叠部分的序列）

具体过程如下：

A．提取总DNA，利用DNA提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌基因组的总DNA备用；

B．片段A（skf上游部分序列）的PCR扩增，以步骤A所提取的枯草芽孢杆菌基因组的总DNA为模板，根据枯草芽孢杆菌基因组序列（GenBank 序列号CP010052.1）设计如下引物：

P1，5′-TGCGCTGACGTCGATTACCTGGGTTGGTGCGTTA-3′；

P2，5′-CTGTCAAACATGAGAATTACGTGTCATAGCAATACT-3′；

P2引物中5′端的CTGTCAAACATGAGAATT部分序列属于与片段B（四环素抗性基因表达序列）接头处的重叠区域；

PCR扩增，扩增产物经电泳并提取回收备用；

C．片段B（四环素抗性基因表达序列）的PCR扩增，以质粒pBR322为模板，根据质粒的序列设计引物如下：

P3，5′-AGTATTGCTATGACACGTAATTCTCATGTTTGACAG-3′；

P4，5′-TATCAAACACTAATCCAAGTCACCCGAGATGCGCC-3′；

P3引物中5′端的AGTATTGCTATGACACGT部分序列属于与片段A（skf上游部分序列）接头处重叠区域；

P4引物中5′端的TATCAAACACTAATCCAA部分序列属于与片段C（skf基因下游部分序列）接头处重叠区域；

PCR扩增，扩增产物经电泳并提取回收备用；

D．片段C（skf基因下游部分序列）的PCR扩增，以步骤A所提取的枯草芽孢杆菌基因组的总DNA为模板，根据枯草芽孢杆菌基因组序列（GenBank 序列号CP010052.1）设计如下引物：

P5，5′-GGCGCATCTCGGGTGACTTGGATTAGTGTTTGATA-3′；

P6，5′-TCCGGACCCGGGCCATAAAAGTAATAGAAACACAGTAAAG -3′；