[发明专利]一种sgRNA碱基错配靶位点文库及其应用有效
| 申请号： | 201510616396.7 | 申请日： | 2015-09-25 |
| 公开（公告）号： | CN105316322B | 公开（公告）日： | 2018-12-07 |
| 发明（设计）人： | 杜权;郑婷;侯英子 | 申请（专利权）人： | 北京大学 |
| 主分类号： | C12N15/11 | 分类号： | C12N15/11;C12N15/63;C12N15/66;C12Q1/68;C40B40/06;C40B40/02;C40B50/06 |
| 代理公司： | 北京万象新悦知识产权代理有限公司 11360 | 代理人： | 贾晓玲 |
| 地址： | 100871*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 sgrna 碱基 错配靶位点 文库 及其 应用 | ||
1.一种针对一个sgRNA序列的cDNA文库的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）获得一个sgRNA分子的序列；
（2）获得针对步骤（1）所述sgRNA分子种子区的所有可能的单碱基错配的靶位点片段；当所述单碱基错配靶位点片段的转录产物与sgRNA片段互补配对时，在sgRNA分子种子区存在一个碱基的错配；
（3）将与所述sgRNA分子完全匹配的靶位点序列片段、以及步骤（2）中获得的与所述sgRNA序列存在单碱基错配的靶位点序列片段，连接到报告基因载体系统中。
2.一种针对一个sgRNA序列的cDNA文库的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）获得一个sgRNA分子的序列；
（2）获得针对步骤（1）所述sgRNA分子的所有可能的单碱基错配的靶位点片段；当所述单碱基错配靶位点片段的转录产物与sgRNA片段互补配对时，存在一个碱基的错配；
（3）将与所述sgRNA分子完全匹配的靶位点序列片段、以及步骤（2）中获得的与所述sgRNA序列存在单碱基错配的靶位点序列片段，连接到报告基因载体系统中。
3.权利要求1或2所述的文库构建方法，其特征在于，步骤（3）中所述报告基因载体为可激活的报告基因载体。
4.权利要求3所述的文库构建方法，其特征在于，所述报告基因为萤火虫荧光素酶报告基因或荧光蛋白报告基因。
5.权利要求1或2所构建的cDNA文库用于检测sgRNA脱靶效应的方法，包括以下步骤：
（1）获得sgRNA或sgRNA表达载体；
（2）获得权利要求1或2所述的sgRNA单碱基错配的靶位点载体文库；
（3）将步骤（1）中获得的sgRNA或sgRNA表达载体、步骤（2）中获得的单碱基错配靶位点文库、以及表达核酸酶cas9的载体或核酸酶cas9转入细胞中；
（4）检测sgRNA对单碱基错配靶位点的切割。
6.一种试剂盒，包括权利要求1或2所构建的cDNA文库。
7.权利要求6所述的试剂盒，还包括sgRNA或sgRNA表达载体，核酸酶cas9或其表达载体。
8.权利要求1或2所构建的cDNA文库用于Cas9蛋白序列优化的用途。
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