[发明专利]一种沾化冬枣叶片愈伤组织的培养方法

说明书

技术领域：

本发明属于植物组培领域，具体涉及一种沾化冬枣叶片愈伤组织的培养方法。

背景技术：

枣树(ZizyphusjujubaMill)是我国的特有果树，具有很高的生态和经济价值。沾化冬枣是枣类中最优良的的品种之一，北京市营养源研究所分析化验表明：沾化冬枣富含人体所需的19种氨基酸和多种维生素，其中维生素C的含量是苹果的70倍、梨的100倍、金丝小枣的20倍，还含有钾、钠、铁、铜等多种微量元素，营养价值居“百果之冠”，被誉为“活维生素丸”。但由于冬枣高度杂合、花小、人工去雄难、坐果率低、胚败育等方面的缘故，杂交育种工作难以开展，极大地限制了良种繁育和推广，冬枣产量远远满足不了现实的需要。因此，优良冬枣繁育和推广有着广阔的发展空间。

生产中多采用选择自然芽变与根蘖苗分株、扦插和嫁接等方法进行繁育，利用根孽分苗繁殖，需与嫁接繁殖相结合，不仅费工费时，成苗率较低，且易侵染各种植物病毒，如枣疯病类菌原体(MOL)等。而愈伤组织是进行植株再生、细胞培养、原生质体培养及融合、细胞生理生化研究和遗传改良等研究工作的基础材料，在植物组织培养中具有重要的应用价值。因此，开展枣树组培研究，对加速优良品种繁殖，培育无病毒苗，开展细胞融合和体细胞杂交等生物工程技术育种有着极其重要的意义。

由枣树茎尖、茎段进行组培快繁国内外已进行了不同程度的研究，但诱导率差强人意。而叶片取材方便，来源广泛，操作容易，从理论上讲是进行枣树组织培养育种快繁的很好的外植体材料。枣树叶片培养的研究也有一些报道。但其愈伤组织培养再生植株的系统研究报道极少。在组织培养过程中，常会遇到污染、褐变和玻璃化等问题使试验失败，给科研和生产造成损失，并且出愈率低。

发明内容：

本发明的目的是提供一种最适的沾化冬枣叶片愈伤组织的培养方法，利用该方法能够高效的获得沾化冬枣叶片愈伤组织，其出愈率高达85％以上。

本发明的沾化冬枣叶片愈伤组织的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

选择沾化冬枣水培苗20天叶龄，取自叶基部向上第3-4叶作为外植体，消毒后，接种于诱导培养基上，然后置于温度28±1℃，暗培养或弱光培养，得到冬枣叶片愈伤组织；

所述的诱导培养基，每升含有TDZ(苯基噻二唑基脲)1～1.5mg、麦芽糖20g、琼脂10g，余量为3/4MS培养基，pH5.8。

优选，所述的诱导培养基，每升含有TDZ1.5mg、麦芽糖20g、琼脂10g，余量为3/4MS培养基，pH5.8，然后置于温度28±1℃，暗培养，得到冬枣叶片愈伤组织。

所述的消毒为将外植体用无菌水浸泡10min，于超净工作台内用体积分数70％的酒精进行表面消毒30-60s，无菌水冲洗2-3次，再用体积分数20％次氯酸钠溶液进行消毒5min，无菌水冲洗3-5次。

优选，所述的弱光培养是在500lux光照下进行培养。

MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法见MurashigeT,SkoogF(1962)(Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassaywithtobaccotissuecultures.PhysiolPlant15:473–497)。3/4MS培养基是指将MS培养基中大量元素用量为原来的3/4，其余成份不变。

按照本发明的方法能够高效的获得沾化冬枣叶片愈伤组织，其出愈率高达85％以上，并且无褐变和玻璃化等问题，从而为获得组培苗，实现优良株系的无性快繁，建立一个高效稳定的叶片再生体系，同时也为基因工程操作提供优良的实验材料和遗传转化体系的建立奠定基础。

附图说明：

图1是不同光照条件下冬枣叶片愈伤组织。A、外植体在强光条件下培养14d后愈伤组织的生长情况。B、外植体在弱光条件下培养14d后愈伤组织的生长情况。C、外植体在黑暗条件下培养14d后愈伤组织的生长情况。

图2是第8组冬枣叶片愈伤组织。外植体在3/4MS+1.5mg/LTDZ+2％麦芽糖+1％琼脂，PH调为5.8，弱光培养14天后愈伤组织生长情况。

图3是愈伤组织的增殖生芽。外植体在3/4MS+1.5mg/LTDZ+2％麦芽糖+1％琼脂，PH调为5.8，黑暗培养14天后转入光下培养，诱导出不定芽。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

第一章材料与方法

1.1材料与仪器